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目的:探讨TGFβ1/Smad通路调控兔自体Hamstring腱重建ACL腱骨愈合的作用机制。方法:建立兔自体Hamstring腱重建ACL模型,术后一周处死动物,取膝关节腱骨界面韧带组织后,胶原酶消化法原代培养获得韧带成纤维细胞,取第3-10代细胞,分为A、B两组。A组实验组添加含10ng/m LTGFβ1的DMEM培养基培养,按照TGFβ1作用的时间分为4h、8h、12h、24h、48h,及空白对照组,共6组;B组添加10ng/m L TGFβ1+不同浓度的SB431542(0μmol/L、0.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L)培养48h,其中10ng/mL TGFβ1+SB4315420μmol/L为对照组。分别应用蛋白印迹及细胞免疫荧光技术检测P-Smad2、P-Smad3蛋白及I型胶原的变化。结果:1.韧带成纤维细胞的原代培养;运用胶原酶消化法成功培养出韧带成纤维细胞,用10%FBS/DMEM培养基继续培养,细胞贴壁生长,形态呈梭形,与典型的成纤维细胞相似。2.蛋白印迹检测P-Smad2、P-Smad3蛋白及I型胶原的表达;A组各时间段P-Smad2、P-Smad3蛋白及I型胶原的相对表达量均高于对照组,差异具有显著性(P<0.05)。其中不同时间组P-Smad2蛋白的表达无显著性差异(P>0.05),P-Smad3及I型胶原蛋白的表达呈时间依赖性。随着TGFβ1作用时间逐渐增加,P-Smad3表达在刺激24h后进入平台期,表达无显著性差异(P>0.05)。I型胶原蛋白在刺激4-8h表达无显著性差异(P>0.05),12-48h后各时间组间表达量差异具有显著性(P<0.05);B组P-Smad2、P-Smad3蛋白及I型胶原的表达随着SB431542浓度的增高而减弱,除了SB431542浓度为0.5μmol/L组与0μmol/L组(对照组)差异无显著性(P>0.05)外,其余各组间P-Smad2、P-Smad3蛋白及I型胶原差异具有显著性(P<0.05)。3.细胞免疫荧光;各组细胞培养48h时应用细胞免疫荧光检测P-Smad2、P-Smad3蛋白及I型胶原的表达,A组荧光强度较B组及对照组明显增强,提示其表达水平升高。结论:TGFβ1可通过激活TGF-β1/Smad通路促进自体Hamstring腱重建ACL腱骨愈合中I型胶原蛋白的表达。