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研究背景炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一类反复发作的消化道非特异性炎症。IBD病因尚不明确,可能与遗传背景、环境因素、肠道菌群及机体免疫系统等多因素相关,其中宿主免疫系统对肠道菌群产生异常免疫反应,肠道上皮屏障结构受损及功能障碍可能是IBD发生发展的关键因素。间充质干细胞(mesenchymal stem cell)是一类可诱导分化为成骨细胞、成软骨细胞及脂肪细胞的多能干细胞。MSC的再生修复能力、免疫调节功能、营养作用使其在多种疾病的治疗中具有良好的应用前景。本研究所使用的MSC为人胚胎干细胞体外诱导获得的MSC,前期已对其治疗小鼠实验性结肠炎的疗效进行了初步评估,但该细胞的治疗机制及关键分子尚缺乏研究,本研究对其可能治疗机制进行深入探讨。研究方法1.MSC治疗小鼠实验性结肠炎动物模型的建立及体内定植研究(1)建立小鼠急性、慢性DSS结肠炎模型,MSC静脉注射治疗,并对其治疗效果进行评估。(2)小鼠静脉注射Dil标记的MSC,观察其不同时间在结肠、肝、肺组织的定植,并通过CD31、F4/80免疫荧光染色进行共定位。2.MSC通过提高循环IGF-1水平促进肠粘膜损伤修复(1)小鼠血清进行蛋白芯片检测,筛查可能发挥治疗作用的蛋白。(2)小鼠治疗模型各阶段IGF-1表达水平进行验证性检测,并对其可能来源进行探索(肝脏PCR检测Igf-1转录,免疫组化检测IGF-1表达)。(3)使用IGF-1抑制剂,观察抑制小鼠分泌IGF-1对MSC疗效的影响,检测各组织IGF-1水平,免疫印迹法检测IGF-1下游信号通路蛋白表达。(4)FITC渗漏实验检测肠道通透性,免疫组化检测肠道增殖指标(Ki-67、BrdU)。(5)对小鼠结肠进行转录组测序,分析治疗后基因在转录水平的变化。3.IGF-1对肠上皮增殖修复的体外机制探究(1)CCK-8检测IGF-1刺激对NCM460细胞增殖功能的影响,流式细胞术检对细胞凋亡和周期的影响,免疫印迹法检测下游信号通路变化。(2)类器官培养观察IGF-1刺激对结肠类器官生长增殖的影响。研究结果1.MSC通过提高循环IGF-1水平发挥治疗效果(1)静脉注射MSC能够缓解小鼠结肠炎症状,MSC定植于小鼠肺、肝脏,在肺内MSC多位于血管内,在肝内MSC与巨噬细胞存在共定位。(2)静脉注射MSC提高小鼠血清IGF-1水平,激活肠道IGF1R-AKT-PI3K通路,提高肠道BrdU、Ki-67表达水平,抑制剂阻断IGF-1分泌后治疗作用消失,结肠转录组测序提示多种基因表达存在差异。2.IGF-1对肠上皮增殖修复的体外机制探究(1)IGF-1体外促进NCM460细胞增殖,增加S期细胞比例,抑制细胞凋亡。(2)IGF-1促进小鼠结肠类器官增殖。研究结论1.静脉注射MSC对小鼠结肠炎有治疗作用。2.MSC可能通过提高循环IGF-1水平促进结肠粘膜增殖修复。