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白腐真菌是一种专门用于降解木质素、纤维素、半纤维等物质的真菌。前期研究发现白腐菌SQ01分泌的胞外酶可以转化酚类及非酚类物质、联苯中间代谢物,并且能有效脱色三苯甲烷类染料。由于白腐真菌生长周期和产酶周期较长,所以拓展其染料脱色范围、优化脱色条件及提高其表达量成为目前研究的热点,有助于进一步开发其在工业应用的潜能。在本研究中,我们首先采用单因素法对白腐菌SQ01分泌的锰过氧化物酶(MnP)对偶氮染料的脱色情况进行了研究,并采用响应面法对MnP生物脱色偶氮染料的条件进行了优化。在此基础上,研究了MnP对噻嗪染料染色棉织布的漂白脱色情况。结果显示,影响MnP生物脱色的因素排序为:酶浓度>染料浓度>温度>pH值。最优生物脱色条件为:温度49℃,pH值4.6,染料浓度为85.5mg/L,酶浓度为430 U/L,脱色率为84.5%。MnP作用噻嗪染料染色的棉织布2 h脱色率为16%。表明该MnP在偶氮和噻嗪染料废水生物脱色领域具有潜在的应用价值。为了对白腐菌SQ01分泌的MnP同工酶基因序列进行生物信息学分析及预测,提取其转录组并送到上海生工生物有限公司进行测序。测序完成后,将所得序列进行NCBI BLAST比对,筛选得到7条具有全长的锰过氧化物酶同工酶序列,进而对同工酶进行生物信息学分析。结果显示,MnP同工酶基因序列中G+C的含量均高于60%,在60%-69%之间,热、碱不易使之变性。同工酶的分子质量范围为37.9kD-46.0kD,且中性氨基酸含量均在59%以上,等电点范围在4.18-6.13之间,偏酸性。通过MEGA5软件对同工酶进行系统发育分析,可知序列7546_t、7547_t、8963_t分别与已知的MnP序列XM008043881.1、XM008044277.1、XM008039971.1相似性为100%。运用Signal P4.0软件进行信号肽分析,发现所有同工酶N端均具有信号肽,属于分泌蛋白。通过TargetP Server进行亚细胞定位,预测表明序列7546_t、7547_t、7548_t、14564_t对应的四种同工酶N端具有分泌通路信号肽的可能性较大,与信号肽结果分析一致。此外,MnP同工酶还具有血红素结合位点、底物结合位点、锰和钙等结合位点。为了提高MnP表达量,本研究以白腐菌SQ01的cDNA为模板设计引物PCR扩增mnp序列,将其与质粒pMAL-p2x进行连接,构建重组质粒pMAL-p2x-mnp并成功在大肠杆菌BL21中实现了可溶性表达。使用Prescission Protease酶切Amylose柱纯化后的重组蛋白MnP-MBP,可以明显看出酶切后有新的条带出现,推测其为目的蛋白MnP,测定酶活为0.5 U/mL,活性相对较低。为提高MnP酶活,构建了重组质粒pSKPssM,并制备了里氏木霉Tu6菌株的原生质体,为下一步将带有强启动子信号肽、终止子序列和基因序列的重组质粒在里氏木霉中异源表达做了基础准备工作。综上,本论文首先研究和优化了白腐菌SQ01分泌的MnP对偶氮和噻嗪染料的生物脱色。由于野生菌中MnP含量不高,限制了其在工业方面的应用。对MnP同工酶进行了生物信息学分析和异源表达研究。成功在大肠杆菌中实现MnP的异源表达。由于重组酶活性相对较低,进一步开展MnP在里氏木霉Tu6中异源表达的研究。为进一步拓展MnP在生物脱色领域的应用,提高MnP产量,及将重组酶应用于工业脱色领域奠定了一定的研究基础。