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研究背景原发性肝癌目前是全球五大常见的恶性肿瘤之一,每年新发原发性肝癌患者约六十万,死亡率仅次于胃癌和食管癌,居第三位。目前,我国原发性肝癌发病人数约占全球的半数以上,已经成为严重威胁大众健康和生命的一大杀手,给社会和家庭带来了沉重的负担。广西地处亚热带地区,由于食入含黄曲霉毒素B1的霉变食物等原因,原发性肝癌发病率一直居高不下。目前,临床上针对肝癌的治疗还主要依赖于手术、放疗、化疗等手段,但是放疗和化疗存在毒副作用大、易复发、花费高等缺点,故医学家们在不断的探索新的治疗方法。近年来,肿瘤生物治疗成为继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗方法。在肿瘤生物治疗中,免疫细胞治疗、基因治疗以及病毒／基因治疗已经初现成效,其中CD4+T细胞的过继免疫治疗用于临床,效果良好,但部分CD4+T细胞抗癌的免疫机制,有待进一步阐明。新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)在分类上属于鸟类的副粘病毒科下的副黏病毒属,虽然禽类病毒会引起禽类传染病,但能选择性杀伤肿瘤细胞,对正常组织细胞无明显毒副作用,从而被用于人类的抗肿瘤治疗。肿瘤患者感染NDV后,人体肿瘤消退的这一现象,促使人类对NDV的抗肿瘤作用进行大量的研究。上世纪80年代,NDV抗肿瘤前期临床和临床研究取得了较大的进展。我们课题组2005年以来开展NDV抗肿瘤研究,发现NDV7793具有较强的杀伤人和小鼠喉癌、肝癌和肺癌的作用。对于NDV7793抗肿瘤机制研究,我们的前期研究发现,NDV7793具有激活人和小鼠单核巨噬细胞和NK细胞杀伤肿瘤细胞的能力,这一效应与IFN-y和TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)有关,TRAIL的升高可能与NDV7793的直接刺激作用和IFN-γ的间接作用有关。在此基础上,本课题选择人CD4+T细胞作为NDV7793的效应细胞,观察NDV7793刺激人CD4+T细胞后IFN-γ的分泌情况,同时从基因和蛋白水平检测NDV7793刺激人CD4+T后TRAIL的表达水平,根据TRAIL的表达情况,选取最佳浓度的NDV7793体外激活人CD4+T细胞,观察NDV7793激活的CD4+T细胞对人肝癌HepG2细胞的杀伤效果。最后,进一步研究TRAIL表达的升高是否与IFN-γ的间接作用有关。研究目的研究NDV7793刺激人CD4+T细胞后TRAIL蛋白的表达及其机制,观察NDV7793刺激的人CD4+T细胞对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用。研究内容和方法通过免疫磁珠分选法分选高纯度的CD4+T细胞,采用anti-CD3、 anti-CD28抗体和IL-2活化CD4+T细胞,ELISA方法检测NDV7793刺激人CD4+T细胞后IFN-γ的分泌情况,通过荧光定量PCR和流式细胞术检测NDV7793刺激CD4+T细胞后,TRAIL在基因和蛋白水平的表达情况,同时设立PBS阴性对照组、IFN-α阳性对照组以及UV-NDV组,然后采用乳酸脱氢酶释放法测定NDV7793刺激的CD4+T细胞对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用。最后,利用抗体中和IFN-γ试验进一步分析TRAIL的表达是否和CD4+T细胞IFN-y的释放增加有关,从而初步探讨NDV7793毒株介导CD4+T细胞产生凋亡相关因子TRAIL发挥抗肿瘤效应的机制。研究结果1.免疫磁珠分选法分选得到的CD4+T细胞的纯度达(97.38±0.28)%。2.经过anti-CD3、anti-CD28抗体和IL-2活化后的CD4+T细胞,其CD25和CD69的双阳性表达率可达(29.30±1.08)%,高于PBS阴性对照组(2.40±1.30)%,差异有统计学意义。3.25HU NDV7793刺激CD4+T细胞,CD4+T细胞分泌IFN-γ的水平呈时间依赖性增长,4h时IFN-γ分泌明显上升,16h时达最高水平,24h时开始下降。4.不同效价(12.5HU、25HU、50HU、100HU和200HU) NDV7793刺激CD4+T细胞16h后,IFN-γ分泌水平均高于PBS阴性对照组的IFN-γ分泌量,其中,当NDV7793的效价为25HU时,CD4+T细胞分泌IFN-γ的水平最高。5.25HU NDV7793刺激CD4+T细胞,病毒作用1-8h后,TRAIL mRNA的表达量开始上升,呈时间依赖性增长。6.25HU NDV7793刺激CD4+T细胞24h的TRAIL mRNA的表达量(实验组)与对照组(PBS阴性对照组、IFN-a阳性对照组和UV-NDV刺激组)相比较,实验组明显高于对照组,差异有统计学意义。7.采用不同效价(25HU、50HU、100HU和200HU)的NDV7793刺激CD4+T细胞16h后,25HU NDV7793组的TRAIL蛋白表达量最高,与对照组(PBS阴性对照组、IFN-a阳性对照组和UV-NDV刺激组)比较,差异有统计学意义。8.CD4+T细胞杀伤肿瘤细胞试验结果显示,当CD4+T细胞和肿瘤细胞效靶比为10：1时,25HU NDV7793组的杀伤率显著高于对照组(PBS阴性对照组、IFN-α阳性对照组和未活化的CD4+T细胞组),差异有统计学意义。9.抗体(anti-IFN-γ)中和IFN-y试验结果显示,未加anti-IFN-y的25HU NDV7793组CD4+T细胞TRAIL蛋白表达量最高,当加入的anti-IFN-y的浓度在5μg/mL-25μg/mL范围内,随着anti-IFN-γ的浓度不断提高,TRAIL蛋白的表达量不断下降。结论NDV7793可以增强活化的CD4+T细胞杀伤人肝癌HepG2细胞的能力,杀伤机制可能与NDV7793能够介导活化的CD4+T细胞上调TRAIL蛋白的表达有关。NDV7793介导活化的CD4+T细胞TRAIL蛋白上调可能与IFN-γ的间接作用有关。