香桂化浊胶囊的处方为河北医科大学第一医院临床应用多年的经验方,由肉桂、土大黄、广藿香3种成分组成,具有芳香醒脾、清化湿浊之功效。临床主治因各种疾病后邪留未尽、脾胃内伤所致长期大便溏泄或有粘液、腹胀肠鸣、纳呆或有低热、舌苔白腻或白滑或见微黄、脉濡缓;主要用于慢性肠炎、真菌感染致肠炎证属脾虚湿困的治疗。国内已有学者对其制剂工艺、质量控制及毒理学进行了系列研究报道。香桂化浊胶囊中起主要作用的化学成分为桂皮醛和百秋李醇。本课题在总结其研究工作的基础上,重点对香桂化浊胶囊中桂皮醛的成分进行研究,对其含量测定以及入血后成分桂皮酸的血药浓度和组织分布进行了进一步的研究,从而期望实现对香桂化浊胶囊临床应用的有效性、科学性、合理性。本研究课题采用了多种分析方法,比如高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术等对香桂化浊胶囊进行了研究,在此基础上建立了香桂化浊胶囊中桂皮醛的含量测定的方法,入血后成分桂皮酸的血药浓度和组织分布的测定方法。本课题涉及到药剂学,分析化学,药动学等多学科领域,研究了香桂化浊胶囊中主要成分桂皮醛的含量测定,入血后成分桂皮酸的血药浓度和组织分布的测定,为香桂化浊胶囊临床应用的有效性、科学性、合理性提供参考。第一部分气相色谱-质谱法测定香桂化浊胶囊中桂皮醛的含量目的:建立气相色谱-质谱法测定香桂化浊胶囊中桂皮醛含量,便于更好的控制香桂化浊胶囊的质量。方法:1气相色谱-质谱条件:HP-5弹性石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25μm);载气:He,流速:1.0 m L·min-1,分流比:50:1;采用程序升温,进样口温度:230℃,进样量:1.0μL;离子源:电子轰击(EI)离子源,离子源温度:230℃,电子能量:70e V;柱前压65.072 kpa;四级杆质量分析器。2方法学考察:分别对方法的系统适用性、专属性、线性关系、检测限和定量限,精密度、重复性、稳定性以及加样回收率进行了考察。3桂皮醛含量测定:制备3批供试品溶液进样测定,以标准曲线法计算香桂化浊胶囊中桂皮醛的含量。结果:1方法学考察:香桂化浊胶囊中桂皮醛和其他成分的分离度良好,理论塔板数>50 000;在0.02~4.00 mg·m L-1范围内线性关系良好,线性回归方程Y=281 786X+2E+06,相关系数为0.999 4;最低检测限为0.75μg·m L-1,定量限为2.51μg·m L-1;精密度试验计算桂皮醛的色谱峰峰面积RSD为1.64%,表明该方法精密度良好;稳定性试验计算桂皮醛色谱峰峰面积的RSD为1.76%,表明桂皮醛供试品溶液在24 h内稳定;重复性试验计算桂皮醛的含量,算得RSD为1.81%,表明该方法的重现性良好;计算桂皮醛的平均加样回收率为96.2%,RSD为2.11%。2样品含量测定:以标准曲线法计算香桂化浊胶囊中桂皮醛的含量,以每粒胶囊0.39 g装量计,暂定本品每粒含桂皮醛不得少于0.48 mg。结论:采用GC-MS联用技术对香桂化浊胶囊中的桂皮醛含量进行测定,该方法操作简便,重现性好、专属性强、准确可靠,适用于香桂化浊胶囊中桂皮醛的含量测定。第二部分香桂化浊胶囊中桂皮醛在大鼠体内药代动力学研究目的:本实验通过采用HPLC法对灌胃给药香桂化浊胶囊后大鼠体内桂皮酸的血药浓度进行研究,采用适当的数据处理方式对所得图谱数据进行合理的分析,以提高药物临床治疗的合理性、有效性。方法:1液相色谱条件的考察:考察了不同的流动相、不同波长以及柱温等因素对测定的影响,来确定合适的色谱条件。2方法学考察:分别对方法的系统适用性、专属性、线性关系、检测限和定量限,精密度、重复性、稳定性以及加样回收率进行了考察。3桂皮酸在大鼠体内血药浓度测定:测定桂皮酸在大鼠体内的血药浓度,并绘制平均血药浓度-时间曲线,计算算出药代动力学参数。结果:1液相色谱条件的考察:Diamonsil TM C18(250×4.6 mm,5μm)色谱柱;流动相:甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸;检测波长:270 nm;流速:1.0 m L·min-1;柱温:室温;进样量:20μL;灵敏度:1.0 AUFS。2方法学考察:经HPLC分析理论塔板数按桂皮酸峰计算不低于8000,桂皮酸与其他峰的分离度大于1.5;经测定空白血浆对桂皮酸的分析测定无影响;血浆中桂皮酸的质量浓度为0.2~160μg·m L-1时,桂皮酸的峰面积Y与桂皮酸质量浓度X(μg·m L-1)呈良好的线性关系(r=0.999 4),回归方程为:Y=27.086 X+0.503;桂皮酸最低检测限为0.15μg·m L-1,以S/N=10计,计算桂皮酸定量限为0.2μg·m L-1;精密度试验计算桂皮酸的色谱峰峰面积RSD值分别为2.87%,1.70%,0.48%,表明该方法精密度良好;稳定性试验计算桂皮酸色谱峰峰面积的RSD为2.4%,0.25%,1.01%,表明桂皮酸样品稳定性良好;计算桂皮酸的回收率在规定范围之内,符合要求。3桂皮酸在大鼠体内血药浓度测定:桂皮酸在大鼠体内的血药浓度-时间数据符合一级吸收双室模型。Tmax为15.6 min,t1/2β为11.077 min,结论:本文采用HPLC法,以桂皮酸为参照峰,对色谱条件进行了筛选,经系列方法学考察,结果均符合生物样品测定的要计算,可用于大鼠体内药动学的研究。桂皮醛进入体内很快代谢为桂皮酸,约半个小时血药浓度达到峰值,并很快随时间逐渐降低。桂皮酸血浆药-时曲线呈二室模型,由药代动力学参数表可见,桂皮酸在体内的分布、消除半衰期较短,说明桂皮酸在体内的吸收、分布较快,口服给药能很快达到有效浓度。该方法操作简便,分析速度快,灵敏度高,适用于口服香桂化浊胶囊后桂皮酸的血药浓度测定。第三部分香桂化浊胶囊中桂皮醛在大鼠体内组织分布研究目的:本实验通过采用HPLC法对灌胃给药香桂化浊胶囊后大鼠体内桂皮酸的各组织分布进行研究,,采用适当的数据处理方式对所得图谱数据进行合理的分析,以提高药物临床治疗的合理性、有效性。方法:1液相色谱条件的考察:考察了不同的流动相、不同的波长以及柱温等因素对测定的影响,来确定适合的色谱条件。2方法学考察:对不同组织,分别对方法的系统适用性、专属性、线性关系、检测限和定量限,精密度、重复性、稳定性以及加样回收率进行了考察。3桂皮酸在大鼠体内组织分布的研究:测定桂皮酸在大鼠血浆、肝、肾、心、肺、肾、胃各组织分布,由此分析桂皮醛进入体内后代谢为桂皮酸后的过程。结果:1液相色谱条件的考察:Diamonsil TM C18(250×4.6 mm,5μm)色谱柱;流动相:甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸;检测波长:270 nm;流速:1.0 m L·min-1;柱温:室温;进样量:20μL;灵敏度:1.0 AUFS。2方法学考察:经HPLC分析各组织理论塔板数按桂皮酸峰计算分别不低于8000,桂皮酸与其他峰的分离度大于1.5;空白组织对桂皮酸的分析测定无影响;经分析各组织中桂皮酸的质量浓度为0.4~600μg·m L-1时,桂皮酸的峰面积Y与桂皮酸质量浓度X(μg·m L-1)呈良好的线性关系。各组织标准曲线回归方程分别如下,血浆:Y=27.086 X+0.503,r=0.999 4;肝:Y=0.428 9 X-0.241,r=0.999 9;肾:0.496 3 X+0.382 3,r=0.999 6;心:Y=0.737 X+0.7353,r=0.999 9;肺:Y=0.728 4 X+0.388 6,r=0.999 9;脾:0.7115 X+0.4163,r=0.999 7;胃:Y=0.706 1 X+0.132 2,r=0.999 5。各组织总桂皮酸的最低检测限均为0.15μg·m L-1,定量限均为0.25μg·m L-1;精密度试验计算各组织中低、中、高三种浓度的桂皮酸色谱峰峰面积RSD如下,血浆:2.87%,1.70%,0.48%;肝:2.54%,1.46%,1.02%;肾:2.35%,1.69%,1.21%;心:1.28%,2.43%,2.18%;肺:2.50%,1.70%,2.01%;脾:1.19%,1.84%,0.46%;胃:2.36%,2.46%,1.27%。稳定性试验计算各组织中低、中、高三种浓度的桂皮酸色谱峰峰面积RSD如下,血浆:2.4%,0.25%,1.01%;肝:1.48%,0.83%,1.87%;肾:2.04%,1.94%,1.45%;心:1.15%,1.94%,2.10%;肺:2.08%,1.86%,1.93%;脾:2.52%,1.97%,1.20%;胃:2.25%,2.25%,1.46%。回收率试验计算各组织中低、中、高三种浓度的桂皮酸色谱峰峰面积RSD如下,血浆:99.96%,99.63%,106.55%;肝:86.74%,97.07%,101.92%;肾:87.22%,103.45%,97.93%;心:99.68%,94.17%,97.72%;肺:90.46%,92.39%,95.37%;脾:87.63%,100.52%,101.29%;胃:87.85%,103.22%,98.01%。3桂皮酸的组织分布:脑组织中无法检测到桂皮酸,而在肝、肾、心、肺、脾、胃中均能检测到桂皮酸成分的存在,从药时曲线图可以看出各组织药物含量分布为:胃>肺>肝>肾>脾>心。结论:从桂皮酸组织分布测定结果来看,药物中的桂皮醛成分进入体内很快代谢为桂皮酸,并且浓度很快随时间逐渐降低,约5个小时消除完全,说明桂皮酸在体内的吸收、分布均较快。心样品中的桂皮酸代谢相比较其他组织最快,桂皮酸在肺中持续的时间最长。本文采用HPLC法,以桂皮酸为参照峰,对色谱条件进行了筛选,经系列方法学考察,结果均符合生物样品测定的要求,可用于大鼠体内组织分布的研究。