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微孢子虫（microsporidia）是一类专性细胞内寄生的单细胞真核生物,能感染几乎所有的无脊椎动物和脊椎动物,包括人类,是经济昆虫、鱼类、兔类、产毛动物、啮齿类及灵长类的常见病原,目前已发现约有150个属,1400余种。家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）是人类最早发现的微孢子虫,主要寄生于经济昆虫家蚕,是家蚕微粒子病的病原,因其可以通过胚种垂直传播,因而危害巨大,被列为蚕业生产上的法定检疫对象。我国是一个养蚕大国,每年因微粒子病和带毒种造成的经济损失高达上千万元,因此,研究家蚕微孢子虫具有重要的理论意义和实践意义。事实上,攻克家蚕微粒子病一直是蚕业研究的重点和难点,特别是如何能够在家蚕发病的早期发现并及时采取相应措施,使损失降到最低是目前十分受关注的热点。本实验室完成了家蚕微孢子全基因组测序及框架图的绘制,为家蚕微孢子的研究提供了信息基础。通过生物信息学分析,我们鉴定出一个家蚕微孢子虫serpin型丝氨酸蛋白酶抑制物基因家族,并在已报道的微孢子虫基因组数据中进行检索,发现蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）中也有serpin基因。Serpin基因在多数生物进程中发挥着不同的功能。在生物的进化过程中,病原生物采用特殊的策略逃避宿主的防御机制,已有报道,发现寄生物的serpin能抑制宿主的免疫反应。家蚕微孢子虫有可能分泌serpin蛋白,抑制宿主免疫防御反应中的丝氨酸蛋白酶,下调免疫反应,从而成功寄生于家蚕体内。本研究旨在已有的信息基础上,鉴定家蚕微孢子虫的serpin基因,对其功能进行探索,为家蚕微孢子虫与宿主间的互作研究提供参考。本研究利用生物信息学分析,鉴定出家蚕微孢子虫的serpin基因家族,然后通过转录谱分析,选择其中一条serpin基因序列,进行克隆、原核表达及胶体金免疫电镜定位分析,同时对获得的可溶性表达蛋白进行了功能分析。主要研究结果如下：1.家蚕微孢子虫serpin家族的序列及转录谱分析从家蚕微孢子虫基因组数据库中,通过生物信息学分析,共鉴定了12个serpin,将这12条序列与其他物种的serpin进行多重序列比对发现,家蚕微孢子虫与其它物种的serpin相似性低,然后对serpin RCL区铰链区进行分析,NBO34g0030, NBO42g0004, NBO18g0021,NBO18g0004, NBO372g0002, NBO34g0036, NBO19g0009的P16-P9氨基酸残基都发生了很大的突变,说明它们可能是非抑制型serpin o对家蚕微孢子虫serpin蛋白P1位点的预测发现,NBO124g0001, NBO1569g0001, NBO19g0007, NBO1570g0002, NBO19g0009, NBO372g0002,它们的P1位点预测都是天冬氨酸;NBO18g0004和NBO34g0036的P1位点都是谷氨酸,目前还不能推测这8条serpin蛋白可能的靶标；NBO34g0030, NBO42g0004的P1位点是苯丙氨酸,NBO39gi001 P1位点是酪氨酸,这3个serpin蛋白可能以胰凝乳蛋白酶为靶标；NBO18g0021预测P1位点为赖氨酸,可能的靶标为胰蛋白酶。为了分析感染家蚕后家蚕微孢子虫serpins的转录情况,我们对四龄起蚕的家蚕添食微孢子虫,取感染后1-7天的中肠组织做RT-PCR。转录谱分析表明,serpin NBO1570g0002在添食后1-7天都有转录活性,NBO18g0004, NBO39gi001分别在4-7天,5-7天有转录活性,说明这两个serpin蛋白很有可能在侵染后期发挥作用；而NBO372g0002, NBO34g0030分别在第7天,第5天有转录活性,转录活性没有规律性。综合生物信息学分析及转录谱结果,推测分泌型serpin NBO1570g0002, NBO39gi001有可能参与家蚕微孢子虫与宿主家蚕的互作。2.家蚕微孢子虫serpin基因NBO39gi001克隆及原核表达在信息分析的基础上,结合转录谱分析的结果,选择serpin NBO39gi001,进行克隆、构建表达重组载体pGEX4T-1-NBO39gi001,利用大肠杆菌表达系统表达了目的蛋白,切胶纯化蛋白免疫小鼠制备抗血清,用家蚕微孢子虫的总蛋白作为抗原,western blotting检测,结果出现了一条特异性条带,但与预测的大小不符合,推测其原因可能是serpin与靶标形成了复合物。3.家蚕微孢子虫serpin蛋白的定位及功能初探采用免疫胶体金电镜技术来确定serpin NBO39gi001蛋白表达的特异性及定位特点,结果在成熟孢子的胞原质有胶体金颗粒分布,说明serpin NBO39gi001在成熟孢子中有表达。目前,原核表达的3个serpin融合蛋白—GST-NBO372g002、GST-NBO1570g0002和GST-NBO39gi001,只有GST-NBO1570g0002有可溶性表达蛋白,因此,将原核表达可溶的GST-NBO1570g0002作为研究对象,对其功能进行分析。结果发现GST-NBO1570g0002不能抑制家蚕血液中的酚氧化酶级联反应（PO级联）；也不能抑制丝氨酸蛋白酶Subtilisin及蛋白酶K,推测可能的原因是：第一,家蚕微孢子虫属于真核生物,表达的蛋白要经过修饰,而原核表达系统没有蛋白修饰,因此原核表达的GST-NBO1570g0002没有活性；第二,serpin型丝氨酸蛋白酶抑制物功能多样,GST-NBO1570g0002可能并不参与抑制宿主的PO级联反应；第三,GST-NBO1570g0002对Subtilisin和蛋白酶K没有抑制功能,有可能Subtilisin及蛋白酶K并不是GST-NBO1570g0002的底物。