论文部分内容阅读
目的:脉络膜新生血管是多种眼底疾病共有的基本病理改变,因其累及黄斑区视网膜,常引起反复出血、渗出和后极部视网膜脉络膜瘢痕化而严重影响患者的中心视力。视网膜色素上皮-Bruch膜-脉络膜毛细血管复合体的完整性与CNV的发生发展密切相关。在CNV相关疾病中,RPE屏障完整性的丧失发生在迁移、炎症等病理过程之前。研究发现,属于Ras超家族一员的小分子G蛋白Rap1,对于细胞运动和连接形成具有重要调节作用,可参与调节上皮细胞间和内皮细胞间紧密连接与粘附连接形成,从而影响屏障功能的完整性。我们前期研究已经证实,Rap1的活化形式GTP-Rap1在实验性CNV中表达较正常组织中减少,表明了Rap1与CNV形成的相关性,提示我们增强Rap1的活性或许可以通过加强RPE屏障完整性进而抑制CNV形成,但并未通过体内激活Rap1观察其对CNV的具体作用以及对RPE屏障完整性的影响,因此不能直接确定Rap1在CNV的发生发展中所扮演的角色。本次研究采用激光光凝诱导BN大鼠CNV模型,通过玻璃体腔注射8cpt-c AMP激活Rap1,观察CNV的发生发展情况以及CNV组织中相关因子的表达水平,探讨Rap1对CNV以及RPE屏障功能的具体作用。方法:1 8-10周健康雄性棕色挪威(Brown Norway,BN)大鼠70只,经裂隙灯及眼底镜检查,双眼前节及眼底均正常,随机分为实验组和实验对照组2组,每组35只大鼠,70只眼。采用氪激光(激光参数:波长647nm,光斑直径200μm,功率260m W,曝光时间0.05s)距离视盘边缘2-3个视盘直径,围绕视盘在视网膜大血管之间均匀光凝9-10个点,以见到光凝处有气泡产生提示Bruch膜被击穿为标志,建立大鼠CNV模型。2激光造模后立即给予玻璃体腔注射,实验对照组和实验组分别行玻璃体腔注射生理盐水和8cpt-c AMP,注射剂量为1μl,观察时间:激光后3天、7天、14天、21天、28天。3激光后14天,两组分别随机选取5只大鼠,腹腔麻醉后,颈动脉注射1ml异硫氰酸荧光素—葡聚糖,摘除大鼠眼球,行脉络膜血管铺片,激光扫描共聚焦显微镜观察CNV形成情况,并测定CNV的区域面积,比较两组CNV生成的量。4两组分别随机选取15只大鼠,分别于激光后3天、7天、14天、21天、28天(每个观察时间点3只大鼠,6只眼),腹腔麻醉后,摘除大鼠眼球,行Real-Time PCR方法检测CNV组织中GTP-Rap1、ZO-1、VEGF基因m RNA转录水平,观察上述指标变化趋势,并且两组进行比较。5两组分别选取15只大鼠,分别于激光后3天、7天、14天、21天、28天(每个观察时间点3只大鼠,6只眼),腹腔麻醉后,摘除大鼠眼球,行Western blot方法检测CNV组织中GTP-Rap1、ZO-1、VEGF蛋白表达水平,观察上述指标变化趋势,并且两组进行比较。6采用SPSS22.0软件包对实验数据进行统计分析。结果:1脉络膜血管平铺:激光后14天,光凝部位CNV呈形态不规则的高荧光微血管网,实验组较实验对照组CNV形成明显减少,且具有统计学意义(P<0.001)。2 Real-Time PCR:实验组GTP-Rap1、ZO-1基因相对表达量随观察时间点的延长均呈逐渐增多的趋势,VEGF基因相对表达量呈逐渐减少的趋势。实验对照组GTP-Rap1基因相对表达量随观察时间点的延长呈逐渐减少的趋势,VEGF基因相对表达量呈逐渐增多的趋势。激光后各观察时间点,实验组GTP-Rap1基因相对表达量较实验对照组增多,从第7天开始两组差异具有统计学意义(P<0.001)。VEGF基因相对表达量较实验对照组降低,从激光后第7天开始,差异具有统计学意义(P<0.001)。激光后第14天,实验组ZO-1基因相对表达量较实验对照组增多,差异具有统计学意义(P<0.001)。3 Western blot:实验组GTP-Rap1、ZO-1蛋白表达水平随观察时间点的延长均呈逐渐增多的趋势,VEGF蛋白水平呈逐渐减少的趋势。实验对照组GTP-Rap1蛋白表达水平随观察时间点的延长呈逐渐减少的趋势,VEGF蛋白表达水平呈逐渐增多的趋势。激光后各观察时间点,实验组GTP-Rap1蛋白表达水平较实验对照组增多,从第7天开始两组差异具有统计学意义(P<0.001)。VEGF蛋白水平较实验对照组降低,从第7天开始差异具有统计学意义(P<0.001)。激光后第14天,实验组ZO-1表达水平较对照组增多,差异具有统计学意义(P<0.001)。结论:1激活Rap1可有效加强细胞间紧密连接,增强RPE屏障完整性。2活化的Rap1可通过加强RPE屏障的完整性以及降低VEGF的表达水平显著减少实验性CNV的形成。3本实验为CNV的治疗方案提供了新思路——激活Rap1可能是治疗CNV比较有前景的有效新途径。这将为以后的实验研究提供可靠的理论依据。