前列腺癌是欧美国家男性最常见的恶性肿瘤，死亡率居男性肿瘤的第二位。我国前列腺癌的发病率虽然低于西方国家，但近年来呈显著增长且年轻化趋势。前列腺癌的持续和扩散依赖于雄激素受体传导信号，因此雄激素去势治疗是除外科手术与放射治疗外的标准前列腺癌治疗方法，多数前列腺癌患者在首次接受雄激素去势治疗后都有显著疗效。但经过短暂的缓解期后，几乎所有患者都会复发并由雄激素依赖性前列腺癌发展成高度恶化且广泛转移的雄激素非依赖性前列腺癌，使常规的雄激素去势治疗失去效果。转变后的前列腺癌治疗非常棘手，死亡率极高，因此成为危害老年男性人群健康的重大疾病。对AIPC的转变机制的研究，是目前国内外前列腺癌研究领域的热点，主要包括：雄激素受体基因的扩增、过表达以及突变，AR信号通路异常等。基因表达的改变及信号通路异常，原癌基因、抑癌基因以及生长因子调控失调被认为是ADPC发展为AIPC的主要原因，研究人员运用各种技术发现了大量前列腺癌的相关基因及信号通路。但是前列腺癌的发生发展过程十分复杂，呈现多步骤、多基因复合的特点。另外，多数AIPC研究都是以激素非依赖性细胞PC3、DU145作为模型，因其不表达内源性雄激素受体而产生雄激素抵抗。但前列腺癌的发生发展，以及从激素依赖到非依赖的转变，都不可避免的经历激素与受体的结合，经雄激素-雄激素受体信号通路，将信号传递至细胞内特异靶基因而发挥作用。因此，以上理论都不能合理地阐述AIPC的发生机制，雄激素非依赖性前列腺癌发病仍需进一步深入研究。本研究选择保留了人前列腺癌功能分化特征，同时具有很强雄激素依赖性的LNCaP细胞系作为对象，建立能模拟临床前列腺癌由雄激素依赖转变为雄激素非依赖过程的细胞模型，采用现代细胞生物学、分子生物学、生物信息学技术探索人前列腺癌基因表达改变，进一步揭示雄激素依赖性前列腺癌向雄激素非依赖性前列腺癌转化过程中可能的发生机制，有望为雄激素非依赖性前列腺癌的治疗提供新的理论依据。1.雄激素非依赖性前列腺癌亚细胞模型的建立选择保留了人前列腺癌功能分化特征的LNCaP细胞为基础，以激素递减法诱导建立雄激素非依赖性前列腺癌细胞模型。LNCaP细胞分别经过去雄激素培养液和去雄激素+氟他胺环境连续传代培养后，观察细胞形态学改变并检测细胞增殖能力、侵袭和迁移能力、PSA分泌等生物学活性变化。结果可见，经去雄激素诱导并连续培养30代的LNCaP-A细胞形态发生明显变化：细胞胞体变小，细胞形态由三角形、长梭型、圆形变为不规则；细胞不再均匀分布，多见单个细胞独立生长，同时出现聚集生长现象。细胞增殖能力增高，可以在去雄激素环境快速生长，并对雄激素竞争性抑制剂氟他胺产生抵抗。细胞的侵袭性及迁移能力也大大增强，在无激素环境下仍能恢复部分PSA的分泌，且随时间的延长而增加。说明该细胞模型从形态学以及生物学行为上都很接近临床内分泌治疗形成的AIPC过程，可以用来进行前列腺癌在细胞学以及分子生物学上的发生机制的初探。2.雄激素非依赖性前列腺癌基因表达变化以基因芯片技术对雄激素依赖性LNCaP细胞和雄激素非依赖亚细胞模型LNCaP-A进行全基因表达谱扫描，筛选AIPC形成过程中差异表达基因，同时整合KEGG和PANTHER的在线分析以及MAS等生物信息学工具，对AIPC相关基因进行生物信息通路、基因调控网络及生物学功能等多方面分析，以了解ADPC转变成AIPC后的基因表达变化，并在此基础上筛选ADPC转变成AIPC的关键基因及可能信号通路。对基因芯片测得的原始数据进行分析处理，共比对表达基因12207个。以差异倍数＞2.0为标准，得到雄激素非依赖LNCaP-A细胞与对照组LNCaP细胞差异表达基因347个，其中表达上调基因156个，表达下调基因191个，表明激素非依赖性的前列腺癌细胞在基因表达上发生了明显变化。而对比雄激素非依赖LNCaP-A细胞与去雄激素后再以氟他胺处理的LNCaP-A+F细胞，两组细胞基因表达则无明显差异，这也说明经去雄激素诱导产生的激素非依赖性的前列腺癌细胞生长不再受到雄激素抑制剂的影响，对雄激素抑制剂产生抵抗。应用ToppGene工具对差异表达基因进行归类分析，结果显示下调的基因主要涉及膜蛋白、跨膜蛋白、离子结合、细胞间信号传导、基因表达调控等功能，上调基因的基因功能主要涉及细胞内部基因调控、表达、代谢、可变剪切等。参与细胞内部基因调控、表达、新陈代谢等功能的基因表达水平升高，参与外源性物质进入细胞内部的膜蛋白、信号传导，以及细胞间识别粘附等作用的基因表达水平降低，这也与非依赖性前列腺癌细胞不再受外部去激素调控的实验现象吻合。结合差异表达基因的功能、生物学过程和已发表文献，对该过程中的关键基因及可能涉及的信号通路进行初步分析，表达上调基因中主要有4个基因涉及了4种类型的信号通路，而表达下调基因中有7个基因涉及了多种类型的信号通路。这些基因及相关信号通路的提出为进一步研究AIPC发生机制提供了方向。3.雄激素非依赖性前列腺癌机制的初步探讨采用RT-PCR及western blot方法对TLR2介导的凋亡作用途径、PI3K/AKT途径、MAPK途径等信号通路关键蛋白进行验证，探讨其在激素依赖性前列腺癌向激素非依赖性转化过程中的可能作用。Western结果可见，caspase3、FADD蛋白表达水平均无明显变化，且均未见激活caspase3条带，提示toll-like信号通路中的凋亡作用途径没有参与非激素依赖性前列腺癌的转变。AKT、p-AKT表达均无明显增高，但NF-κB蛋白表达上调，IκBα蛋白表达下降。提示NF-κB可能为信号通路中一个关键位点，但在LNCaP-A细胞系中不是通过PI3K/AKT通路激活，可能存在着其他激活通路，抑制蛋白IκBα表达的下调可能影响了NF-κB表达变化。对MAPK信号通路相关蛋白进行检测，ERK、MEK、JNK蛋白表达均无显著变化，而p38、HSP27、IL-8表达显著升高，提示在LNCaP细胞转变为LNCaP-A细胞的过程中，ERK途径、JNK途径没有参与，但MAPK/p38信号通路发挥了重要作用，IL-8、HSP70都可能是该途径中重要的信息传递分子。有研究表明MAPK/p38在乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌耐药机制中发挥着重要作用，但在前列腺癌激素耐药中尚无报道。这为AIPC机制的研究以及AIPC药物作用靶点的发掘提供了新的理论基础。