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目的:通过研究重组改构人肿瘤坏死因子-α(recombinant mutant human tumor necrosis factorα,rmhTNF-α)对人肝癌细胞SMMC-7721的体外作用,观察rmhTNF-α联合抗癌药物顺铂(cisplatin,DDP)对SMMC-7721细胞体外作用的影响,进一步阐明rmhTNF-α增加DDP抑制肿瘤细胞增殖及诱导凋亡的可能机制。方法:1体外培养人肝癌细胞SMMC-7721,采用四甲基偶氮唑蓝(tetezolium-based colorimetric assay, MTT)比色法检测rmhTNF-α、DDP及两者联合对该细胞增殖的影响。2流式细胞仪测定两者联合对SMMC-7721细胞周期分布和凋亡的影响。3根据MTT的结果,设置对照组(单细胞悬液组)及实验组,分别提取各组细胞总RNA,鉴定其完整性及含量,通过逆转录-聚合酶链反应(revers transcription PCR,RT-PCR)定量检测各处理组处理前后SMMC-7721细胞中存活素(survivin mRNA)的表达水平。4采用流式细胞术(flow cytometry, FCM)半定量检测rmhTNF-α联合DDP处理细胞48h后缺氧诱导因子-1 (HIF-1)蛋白的表达水平。5根据MTT结果,采用isobolanalysis公式分析相互作用指数(Iteraction Index),评价联合后的作用,如相互作用指数>1为两药拮抗作用;相互作用指数=1为两药相加作用;相互作用指数<1为两药协同作用。结果:1 MTT比色法显示rmhTNF-α、DDP及两者联合对SMMC-7721细胞增殖均具有抑制作用。不同浓度rmhTNF-α(0～1600iu/ml)、DDP(0～10μg/ml)处理细胞48h后,与对照组相比,各组OD值均有不同程度下降,差异具有极显著性(P<0.01)。各组之间差异亦具有极显著性(P<0.01)。且两种药物处理SMMC-7721细胞均随药物浓度的增大,对细胞的抑制率逐渐增强,即两种药物对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用呈明显的剂量依赖效应。MTT比色法分析rmhTNF-α联合DDP对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用,显示:400iu/ml、1600iu/ml的rmhTNF-α均可加强DDP对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用,且随rmhTNF-α浓度的增大,其对DDP的协同作用增强。单用DDP的IC50为4.018μg/ml,联合rmhTNF-α(400iu/ml)后可将DDP的IC50降低至2.658μg/ml;联合rmhTNF-α(1600 iu/ml)后可将DDP的IC50降低至1.621μg/ml,因此,rmhTNF-α可加强DDP对SMMC-7721细胞增殖抑制作用。2流式细胞仪检测细胞周期分布显示,各处理组作用SMMC-7721细胞48h后,G0/G1期细胞变化不明显,S期细胞逐渐减少,G2/M期细胞逐渐增多。即rmhTNF-α及二者联合作用于SMMC-7721细胞均可阻滞SMMC-7721细胞周期进程于G2/M期。各处理组处理细胞48h后,流式细胞仪可测得典型的亚二倍凋亡峰,对照组、rmhTNF-α(400iu/ml)组、rmhTNF-α(1600iu/ml)组、DDP(2.0μg/ml)组、rmhTNF-α(400iu/ml)+ DDP(2.0μg/ml)组、rmhTNF-α(1600iu/ml)+ DDP(2.0μg/ml)组分别处理SMMC-7721细胞48h后,凋亡百分率分别为2.32%、6.59%、9.25%、8.13%、16.47%、27.94%。除单独应用rmhTNF-α(400iu/ml)组与对照组比较差异不明显,其他各处理组与对照组比较均有显著差异(P<0.05)。3半定量RT-PCR检测结果显示:rmhTNF-α单独用药组、DDP组及两者联合组处理SMMC-7721细胞48h后,survivin mRNA有不同程度的降低, rmhTNF-α(1600iu/ml)联合DDP组作用48h后对SMMC-7721细胞survivin mRNA表达抑制最显著。4流式细胞仪间接分析细胞HIF-1蛋白表达显示,对照组、rmhTNF-α(400iu/ml)组、rmhTNF-α(1600iu/ml)组、DDP(2.0μg/ml)组、rmhTNF-α(400iu/ml)+ DDP(2.0μg/ml)组、rmhTNF-α(1600iu/ml)+ DDP(2.0μg/ml)组处理SMMC-7721细胞48h后, HIF-1的荧光指数FI值较对照组均减小。比较各处理组和对照组的FI值及联合用药组与单独使用DDP组的FI值,除单独使用rmhTNF-α(400iu/ml)组及DDP组HIF-1蛋白的FI值与对照组无显著差异,其他各组差异均具有显著性(P<0.05)。5 Isobolanalysis分析相互作用指数显示,rmhTNF-α联合DDP在细胞生长抑制率为50%时的相互作用指数为0.74,证明rmhTNF-α确实可协同DDP对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用。结论:1本试验证实在一定浓度范围内,rmhTNF-α能够抑制SMMC-7721细胞增殖,并呈剂量依赖关系。2 rmhTNF-α可增强DDP对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用。3 rmhTNF-α及其联合DDP可阻滞肝癌SMMC-7721细胞于G2/M期并可诱导该细胞凋亡。4 rmhTNF-α增强DDP诱导SMMC-7721细胞凋亡的作用的机制,可能与下调survivin、HIF-1蛋白的表达有关。5 rmhTNF-α可强化DDP诱导SMMC-7721细胞凋亡的作用,推测rmhTNF-α可增加SMMC-7721细胞对化疗药的敏感性。