论文部分内容阅读
棘白菌素B(Echinocandin B,ECB)是一种由环状六肽和脂肪、酸侧链组成的新型脂肽类化合物,它是棘白菌素类药物阿尼芬净的前体物质。由于专利的问题,国内尚无企业生产此类药物,导致其市场垄断、价格高,而此专利在2014年即将到期。因此,现阶段对此药物的高效生产技术进行研发,实现其国产化,将有助于打破国际制药企业的垄断,为患者提供价廉质优的抗真菌药物,具有重要的经济和社会效益。目前在ECB的发酵过程中最主要的问题是其发酵水平仍然较低,因此亟待在菌株生产能力和发酵代谢过程控制等方面取得突破。本文以ECB生产菌株Aspergillus nidulans ZJB0817为研究对象,主要开展了菌种培养条件优化,关键前体物质添加对代谢过程的影响,微粒和剪切力对菌体形态及ECB产量影响,以及发酵罐发酵工艺优化等工作,并得到以下结果:首先优化了菌株ZJB0817摇瓶培养条件。确定摇瓶中最佳培养条件为:种龄56 h,接种量12%,装液量50 ml/250 ml,初始pH 7.0,发酵温度为前3天37℃,后9天25℃,摇床转速220 rpm,培养12天。培养基中最佳金属离子浓度为(g/L):MnSO4·H2O 0.2，CaCl2 0.4,CuSO4·5H20 0.6。在最佳培养条件下,摇瓶中ECB产量可达到1071 mg/L,比初始条件(724mg/L)的产量提高了 47.9%。其次考察了关键前体物质的添加以及微粒和剪切力对ECB产量的影响。实验发现前体物质酪氨酸、L-苏氨酸、鸟氨酸以及L-脯氨酸的添加对ECB产量均有影响,在发酵培养初期添加5 g/L酪氨酸或者1 g/L L-苏氨酸,并且在第3天添加2 g/L鸟氨酸,第6天添加2 g/L L-脯氨酸可使ECB产量显著提高,在上述条件下ECB产量可分别达到1426 mg/L和1444 mg/L,比原始培养基分别提高了 33.1%和34.8%。除此之外,微粒和剪切力对菌体形态影响显著,添加20 g/L(325目,粒径14.2 μm)滑石粉使ECB产量提高至1262 mg/L,比对照组提高了 33.1%。采用发酵前中期适当增大剪切力,发酵后期减小剪切力的方法,能使ECB的发酵水平提高。最后考察了发酵罐中通气量及搅拌转速对ECB发酵产量的影响,确定发酵罐中最佳通气量为1.7 WVM;在培养前6天搅拌转速控制在600 rpm,后9天搅拌转速控制在400 rpm,能够使发酵罐中ECB产量得到较优的结果,在上述条件下,ECB产量为608 mg/L,比初始条件提高了 193%。