草莓类胡萝卜素基因psy、pds遗传转化研究

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草莓(Fragaria X ananassa Duch.)属蔷薇科多年生草本植物,果实红嫩多汁且富含营养,素有‘水果皇后’的美称。近年来,随着草莓经济价值的逐步升高,其果实品质开始受到越来越多人的重视。类胡萝卜素不仅是果实品质的重要指标,还是维生素A的前体,在防癌抗癌方面起到重要作用,然而,目前主栽的草莓品种中类胡萝卜素含量普遍偏低,因此,设法提高草莓中类胡萝卜素的含量显得十分必要。八氢番茄红素合成酶(PSY)和八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是类胡萝卜素生物合成过程中的关键酶。随着psy、pds基因在类胡萝卜素生理机制研究中的不断深入,使之应用基因工程技术调控草莓中类胡萝卜素含量成为可能。本研究以草莓为材料,在优化草莓再生体系和遗传转化体系的基础上,开展草莓psy、pds基因转化草莓的研究,主要结果如下:1.建立了草莓叶片高频离体再生体系以‘福莓一号’,‘红实美’两个草莓品种为材料,草莓叶片为外植体,MS为基本培养基,通过添加3种植物激素6-BA,IBA和2,4-D,探讨不同植物激素组合和配比对草莓叶片不定芽诱导的影响。结果表明:‘福莓一号’叶片诱导不定芽的最佳培养基为MS+2.0mg·L-116-BA+0.1mg·L-12,4-D,诱导率可达85.7%。‘红实美’叶片诱导不定芽的最佳培养基为MS+2.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1BA,诱导率可达81.9%。2.构建了草莓psy、pds基因植物表达载体pCAMBIAl301psy-pds依据已报道的草莓psy、pds基因全长序列,设计特异引物,分别克隆psy、pds基因的开放阅读框,然后将psy、pds基因的开放阅读框分别插到植物表达载体pCAMBIA1301和pBI121的CaMV35S启动子和Nos终止子之间,构建植物表达载体pCAMBIA1301psy和pBI121pds,接着,将带有启动子、终止子、gusA基因和pds基因的片段引入pCAMBIA1301psy,最终获得psy、pds基因植物表达载体pC AMBIA1301psy-pds。3.优化了农杆菌介导草莓遗传转化体系并得到部分转基因植株通过确定草莓叶片不定芽诱导过程中潮霉素(Hyg)和羧苄青霉素(Carb)的选择压,对农杆菌介导草莓遗传转化体系进行优化。结果表明,菌液适宜的侵染浓度为OD600=0.2,侵染时间10min最佳,预培养和共培养时间均以48h为宜,潮霉素和羧苄青霉素浓度分别为5mg.L-1和500mg.L-1时,转化效果较好。本次试验共获得11株草莓抗性植株,经PCR检测表明,其中有9株为转psy、pds基因植株。4.建立了UPLC测定草莓果实中类胡萝卜素含量的标准体系通过对不同提取剂、提取方法的筛选,优化草莓果实类胡萝卜素的提取条件;通过确定吸收波长、色谱条件以及重复性、精密度、回收率试验,建立类胡萝卜素超高效液相色谱法标准分析体系。结果表明,以丙酮:石油醚=1:2作为提取剂,皂化提取草莓果实中类胡萝卜素,同时采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱,以乙腈:甲醇=9:1为流动相,在450nm下测定是进行草莓果实类胡萝卜素定性定量分析的最佳方法。
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