论文部分内容阅读
[目的]本研究以风药干预肺腺癌侵袭转移临床疗效显著的基础上,结合文献分析和药理研究数据并进行主要药效学实验,以与肺腺癌侵袭转移密切相关的PHD2/HIF-1α信号通路为切入点,选择小鼠Lewis肺癌LL/2细胞为研究对象,探索风药对lewis肺腺癌细胞增殖转移的影响,进一步通过比较蜈蚣全蝎对药、蜈蚣单药、全蝎单药对Lewis肺癌荷瘤小鼠的干预效应,从肿瘤新生血管生成、缺氧微环境、肿瘤转移等角度初步探讨其干预效应的相关机制,为肺腺癌辩证用药、合理配伍提供初步的理论和实验依据。[方法](1)搭建数据库:通过文献查阅建立“风药—肺腺癌侵袭转移“数据库,筛选抗肺腺癌侵袭转移中用药频率最高的前五组风药(1-5组);(2)干预Lew is肺癌LL/2细胞增殖转移实验:构建小鼠Lewis肺癌LL/2细胞稳定培养、传代、冻存及复苏细胞;以PI染色,流式细胞术检测细胞周期;以细胞增殖实验(CCK8)检测细胞增殖能力并绘制生长曲线;以克隆形成实验检测含风药血清对LL/2肺腺癌细胞在平皿上的集落形成能力;以软琼脂成瘤实验检测细胞的成瘤能力;以Annexin V/PI流式检测肺腺癌细胞的凋亡能力;以划痕愈合实验、Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力,以评价风药血清对肺腺癌体外干预效果,筛选出药效最佳的一组风药;(3)干预lewis肺癌小鼠皮下原位癌实验:建立小鼠Lewis肺癌LL/2细胞小鼠模型,将体外实验筛选出最佳风药组制成水煎剂灌胃,并将各模型组随机分为空白对照组、模型组、顺铂组、蜈蚣-全蝎组、蜈蚣组、全蝎组,分组后各组均按人鼠等效剂量给药,连续给药21天,检测各组一般情况、肿瘤生长曲线,瘤重、瘤重抑制率、肺重、肺体积等;以石蜡组织切片HE染色,观察肿瘤细胞及转移灶情况;以Western blot法检测组织中HIF-Iα、PHD-2、MMP-2表达变化等,以ELISA法检测组织中VEGF表达情况,验证各组干预肺腺癌细胞侵袭转移的效果。(4)干预lewis肺癌小鼠血行转移实验:以尾静脉注射法建立小鼠Lewis肺癌LL/2细胞小鼠血行转移模型,并将各模型组随机分为空白对照组、模型组、顺铂组、蜈蚣-全蝎组、蜈蚣组、全蝎组,分组后各组均按人鼠等效剂量给药,连续给药21天,检测各组小鼠的一般情况、肿瘤生长曲线,肺重、肺体积、肺转移灶及抗转移率等;以石蜡组织切片HE染色,观察肿瘤细胞及转移灶情况;以Western blot法检测组织中HIF-Iα、PHD-2、MMP-2表达变化等,以ELISA法检测组织中VEGF表达情况,验证各组干预肺腺癌细胞侵袭转移的效果。[结果](1)文献筛选:前5组高频风药为:地龙-僵蚕组>蜈蚣-全蝎组>荆芥-防风组>川芎-柴胡组>麻黄-桂枝组;(2)干预Lewis肺癌LL/2细胞增殖转移实验:川芎-柴胡组、蜈蚣-全蝎组、地龙-僵蚕组的含药血清较能更显著抑制LL/2细胞侵袭,其中蜈蚣-全蝎组能力更显著;各风药组别的含药血清对LL/2细胞周期的影响无显著差别;地龙-僵蚕组、蜈蚣-全蝎组、荆芥-防风组的含药血清对LL/2细胞软琼脂成瘤能力有抑制作用,地龙-僵蚕组与蜈蚣全蝎组含药血清对LL/2细胞克隆形成能力有抑制作用;地龙-僵蚕组、蜈蚣-全蝎组、川芎-柴胡组的含药血清对LL/2细胞的活力有明显抑制作用;(3)干预lewis肺癌小鼠皮下原位癌实验:各药组对小鼠肺重的影响:B组小鼠的肺重减少最少,与A组比较差异更显著(P<0.01),C组、E组的肺重与A组比较,具有差异性(P<0.05)。各药组对肺转移灶及抗转移率的影响:B组的肺转移灶计数与A组比,具有更显著的差异性(P<0.01),且B组的抗转移率最高。各药组抗转移率由高到低为:C组>D组>E组。组织学观察:肺脏组织学观察:DDP组>蜈蚣-全蝎组>全蝎组≈蜈蚣组。各药物组均有不同程度上抑制VEGF表达的作用,其中DDP组作用最显著,其次为蜈蚣-全蝎组、全蝎组;(4)干预lewis肺癌小鼠血行转移实验:各药组对小鼠肺重的影响:B组小鼠的肺重减少最少,与A组比较差异更显著(P<0.01),C组、E组的肺重与A组比较,具有差异性(P<0.05)。各药组对肺转移灶及抗转移率的影响:B组的肺转移灶计数与A组比,具有更显著的差异性(P<0.01),且B组的抗转移率最高。各药组抗转移率由高到低为:C组>D组>E组。组织学观察:肺脏组织学观察:DDP组>蜈蚣-全蝎组>全蝎组≈蜈蚣组。各药物组均有不同程度上升高PHD2表达水等,抑制HIF-Iα、MMP-2/VEGF表达的作用,其中DDP组作用最显著,其次为蜈蚣-全蝎组、全蝎组。[结论]风药干预肺腺癌侵袭转移效果明显,其通过调控PHD2/HIF-1α信号通路,干预VEGF、MMP-2的含量,降低肿瘤血管生长,调控肿瘤微环境异质性,从而抑制肺腺癌的侵袭转移。