目的:原发性肝癌为我国常见恶性肿瘤之一,原发性肝癌具有高侵袭性,易迅速发生肝内外的侵袭及转移,每年约有60～70万例发生在中国大陆。在我国,乙型肝炎病毒(HBV)感染是原发性肝细胞癌(HCC)发病的最主要原因,我国约有1.2亿乙型肝炎表面抗原携带者,每年约有12万人死于PLC。而针对HBV的研究大多集中在流行病学方面,其具体诱发肝癌的机制至今仍不清楚。近几年研究较多的是HBV基因组中的HBX蛋白,它具有强大的反式激活作用,在肝癌的发生、发展中发挥作用。但HBV整合的随机性,基因易突变性均导致原发性肝细胞癌发生的复杂性。缺氧是存在于大多数实体肿瘤中的现象,缺氧诱导因子(HIF)是肿瘤细胞维持氧平衡的重要的转录调节子。缺氧条件下,HIF通过与靶基因上的缺氧反应元件(HRE)结合而促进靶基因转录,其蛋白质产物发挥多种生物学功能,如参与肿瘤血管的形成与发展,肿瘤细胞能量代谢,肿瘤细胞增殖与存活等。多项研究表明,低氧和氧化应激都已知的HIF的诱导机制,HIF途径是在缺氧条件下启动的一个关键的信号通路,与多种疾病的始动有关,并引起VEGF的表达发生变化。VEGF是目前公认的刺激肿瘤血管生成的最主要因子。VEGF广泛分布于人和动物的脑、肾、肝、脾、肺及骨骼等组织,参与正常胚胎发育、卵泡成熟及肾脏等生理性调节,并在炎症、创伤愈合、特别是在肿瘤相关的微血管形成、侵袭和转移中发挥重要的作用。近年的研究表明VEGF在肝癌组织中表达明显高于正常肝组织,在肝癌的发生、生长、浸润和转移过程中发挥着重要的作用。而HBV感染与低氧条件能否协同诱导肝癌细胞VEGF的表达目前还不清楚。方法:本实验选取人肝癌HepG2细胞、HepG2.2.15细胞,分别在常氧与缺氧条件下体外培养,用倒置显微镜观察两株细胞形态学变化。在不同时间点(2h、6h、12h、24h、48h)检测二者在不同条件下VEGFmRNA及蛋白表达的差异,用Westen-Blot法检测VEGF蛋白表达;半定量RT-PCR技术检测细胞中VEGFmRNA相对表达量。通过分析HBV转染前后,常氧和缺氧条件下VEGFmRNA和蛋白表达的差异,探讨HBV感染和缺氧环境在肝癌侵袭、转移过程中所起的作用,为从病因学及抗血管生成方面治疗肝癌提供实验理论基础。本课题包括以下三方面内容:①HepG2细胞、HepG2.2.15细胞的培养及低氧处理;②RT-PCR法检测HepG2细胞、HepG2.2.15细胞VEGFmRNA的表达量;③Western-Blot法检测HepG2细胞、HepG2.2.15细胞VEGF蛋白含量。结果:①肝癌细胞在HBV转染前后,均表达VEGFmRNA及VEGF蛋白。②转染HBV病毒后的HepG2.2.15细胞表达VEGFmRNA水平较HepG2细胞高(p<0.05)。常氧状态下,HepG2、HepG2.2.15细胞表达VEGFmRNA,经缺氧处理后,两株细胞表达VEGFmRNA水平较常氧状态下均有显著上升,各缺氧组与常氧组之间比较有统计学意义(p<0.05)。且随缺氧时间的延长,表达VEGFmRNA的量逐渐增加(相关系数分别为0.482和0.975)。③与HepG2细胞相比,转染HBV的HepG2.2.15细胞表达VEGF蛋白较高,比较有统计学意义(p<0.05)。常氧状态下,两株细胞均表达VEGF蛋白,经过低氧处理后,两株细胞表达VEGF蛋白水平较常氧状态下均有增高,各缺氧组与常氧组之间比较有统计学意义(p<0.05)。且随时间的延长,两株细胞VEGF蛋白表达量均逐渐增加相。(相关系数分别为0.823和0.822)。结论:①当从常氧进入低氧条件后,VEGF在肝癌细胞内表达量增高,且随着缺氧时间的增加,VEGF的转录、翻译水平则随之增加,说明肝癌细胞在缺氧应急下,通过细胞内一系列调节途径,在短期内即可表达VEGF来适应低氧环境。②经过HBV感染的肝癌细胞HepG2同样有VEGF表达量增加的趋势,且随缺氧时间的增加而表达量增加,说明HBV感染可能协同低氧环境的刺激,在基因水平上也影响了VEGF的表达,使其表达增强,这可能是肝癌细胞在HBV感染作用的协同下,为适应缺氧微环境并维持其生长和侵袭的重要调控环节,进而通过调控其他靶基因的表达进一步促进肝癌细胞的生长。③抗VEGF治疗,进而改善肿瘤细胞缺氧内环境,从而使抗VEGF治疗技术逐渐成为肿瘤治疗的成熟途径。