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Rep介导的定点整合将AAV基因组插入人类基因组19号染色体的AAVS1位点,该机制用于基因治疗研究可以实现目的基因安全长期地表达。用Rep-AAVS1定点整合系统作基因转移时,为克服Rep蛋白的细胞毒性作用,维持Rep蛋白低水平瞬时表达是一个有待解决的问题。驱动Rep蛋白表达的AAV-2P5启动子是一个多功能的元件,可作为定点整合的底物以及反馈调控Rep的表达。P5-Rep表达框架反式提供Rep蛋白可以低水平表达Rep蛋白,但是由于P5启动子本身是高效的定点整合底物,一方面和顺式定点整合元件竞争从而降低带有目的基因的顺式元件的整合效率,另一方面P5-Rep整合进AAVS1位点会使得Rep长期表达造成安全性隐患。本研究试图通过突变分析来解析P5启动子定点整合和反馈调控的分子基础,尝试寻找一种可以去掉定点整合功能而保留反馈调控活性的,具有应用价值的P5启动子突变体。 在P5启动子内核心区段TATA/RBE/Yyl进行的突变分析显示,P5 RBE对P5的定点整合效率和有效的反馈调控能力都是必需的。虽然TATA box和Yyl+1位点的突变会造成P5启动子定点整合效率严重下降(分别只有8.3％和10.4％,野生型P5为34.0％以上),但是前者的突变只引起P5启动子反馈调控能力一定程度下降而后者的突变则几乎不会影响P5启动子的反馈调控能力。对P5 RBE内的核苷酸进行了更加细致的突变分析发现:P5 RBE中266GAGTGAGC273这一序列内单个核苷酸的突变能造成P5启动子定点整合和反馈调控Rep蛋白表达两种功能的分化,其旁侧序列对P5启动子的功能几乎没有影响。该序列内的单核苷酸突变造成P5启动子定点整合能力的剧烈下降,但能保持有效的反馈效率,其中以C273T这一突变体的分化程度最高(6.5％的定点整合效率和76.0％的反馈调控效率)。体外Rep-P5RBE结合实验观察到P5启动子的反馈调控能力主要依赖于Rep-P5RBE之间的亲和力强弱,而其定点整合于AAVS1的能力不只是与Rep-P5RBE之间的亲和力有关,还存在其他的因素。这些因素中,很可能包括P5RBE中266GAGTGAGC273这一序列本身的同源性。 上述P5启动子结构-功能上关系的研究结果提示P5启动子的定点整合和反馈调控Rep蛋白表达这两种功能是可以分化的。并为Rep介导的定点整合机制及P5启动子的反馈调控机制的进一步完善,提供了新的视角和观点。而在基于Rep介导的定点整合基因转移系统中,用C273T这一P5启动子的突变体反式提供Rep蛋白是一个很好的选择,它可以安全的提供瞬时、低水平的Rep蛋白表达。