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目的:研究柯萨奇病毒A组6型(CoxsackievrusA6,CA6)诱导细胞凋亡的分子机制,为其导致的手足口病的发病机理提供依据。 方法:通过4株编号分别为:CC046、CC097、CC098和CC099的不同来源的CA6病毒长春株分别体外感染4种不同细胞系,包括2种非神经细胞(RD细胞、HeLa细胞)和2种神经细胞(A172细胞、U87细胞),观察不同细胞系的病理改变,台盼蓝染色法进行活细胞计数,初步阐明CA6病毒是否可以诱导神经细胞和非神经细胞发生CPE现象;选取对CA6病毒最为敏感的RD细胞,采用AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞凋亡,观察CA6病毒在RD细胞中介导的凋亡相关的细胞膜变化;通过体外构建单独表达CA6病毒2C蛋白的质粒CC046-C-HA-2C和CC098-N-HA-2C,转染RD细胞,显微镜观察细胞形态变化并采用Western blot方法检测与CA6病毒及CC046-C-HA-2C和CC098-N-HA-2C对RD细胞感染的相关蛋白水平。 结果:通过用05MOI的4株具有代表性的不同CA6病毒分别感染4种不同细胞系,根据病理改变和活细胞计数结果,表明CA6病毒可以诱导神经细胞和非神经细胞发生CPE现象,且RD细胞对CA6病毒的敏感性最强,故选用RD细胞进行凋亡机制研究;采用AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞凋亡,观察4种CA6病毒在RD细胞中诱导的凋亡情况,其早期凋亡率分别为:CC046(20.76%)> CC098(10.94%)> CC097(5.92%)> CC099(492%),其晚期凋亡率分别为:CC046(54.20%)> CC098(27.90%)> CC099(18.28%)>CC097(13.80%)推测4种CA6病毒致早期凋亡的毒力大小顺序为:CC046> CC098>CC097> CC099,致晚期凋亡的毒力大小顺序为:CC046> CC098> CC099> CC097;通过体外构建单独表达CA6病毒2C蛋白的质粒CC046-C-HA-2C和CC098-N-HA-2C,转染RD细胞,显微镜观察细胞形态变化发现CC046-C-HA-2C和CC098-N-HA-2C确实能够造成RD细胞死亡;并采用Western blot方法检测与CA6病毒及CC046-C-HA-2C和CC098-N-HA-2C蛋白对RD细胞感染的相关蛋白水平,结果CA6病毒诱导细胞凋亡的标志蛋白Caspase-8、9各组间蛋白条带差别不明显;CC046-C-HA-2C、CC098-N-HA-2C对RD细胞感染的相关蛋白水平:细胞焦亡标志蛋白Caspase-1、IL-18和IL-1β无明显变化趋势;凋亡标志蛋白Caspase-3有上调趋势,但无统计学意义;自噬标志蛋白LC3无明显变化趋势。 结论:CA6病毒可以诱导神经细胞和非神经细胞发生CPE现象;RD细胞对CA6病毒的敏感性最强;CC046病毒株毒力最强,CC098病毒株次之。Western blot检测CA6病毒诱导细胞凋亡的标志蛋白Caspase-8、9条带不明显,初步判定是因为4种CA6病毒毒力较弱,或是CA6病毒诱导细胞凋亡不一定是通过经典的Caspase通路调控,可能是通过其他凋亡途径,我们在后续的实验中会在其他通路上做相关研究;CC046-C-HA-2C和CC098-N-HA-2C蛋白转染确实能够造成RD细胞死亡,但并没导致最明显的标志蛋白出现变化,其是否通过其他蛋白起作用还有待进一步深入研究,进而确定具体细胞死亡方式。