论文部分内容阅读
本实验研究目的是:了解大鼠CSCs电生理特性,观察CSCs移植后对大鼠心肌梗死心电生理的影响。
第1章心肌干细胞的分离,培养,鉴定与诱导分化CSCs在心肌组织中数量极少。选择一个有效的操作简便的体外分离纯化的方法,在CSCs研究中尤为重要。本实验部分应用贴壁分离法对CSCs进行体外分离、纯化培养和鉴定,并对CSCs进行诱导分化。
1.1实验目的:建立大鼠CSCs体外分离培养方法,为下一步研究CSCs离子通道和观察CSCs移植对大鼠心肌梗死心电生理的影响提供充足细胞资源。
1.2材料与方法:取新生Sprague Dawley(SD)大鼠,在无菌条件下取心脏组织,采取贴壁分离和消化控制相结合办法分离纯化CSCs,观察细胞形态变化。采用流式细胞仪检测细胞表面抗原:c-kit,CD29,CD90.1,CD11b/c,CD34,CD45的表达,进行CSCs鉴定。以及应用心肌球培养液诱导CSCs分化,并行细胞免疫化学检测:肌钙蛋白Ⅰ、α-肌动蛋白和结合蛋白。
1.3结果
1.3.1 Po(原代)及P1代(经过1次传代为P1代,如此类推)细胞常有杂质细胞。P2及P3代时,得到较纯的CSCs。
1.3.2流式细胞仪鉴定结果显示:c-kit,CD29,CD90.1为阳性,CD11b/c,CD34,CD45为阴性。
1.3.3 CSCs诱导分化结果:CSCs经培养液诱导2周后,细胞免疫化学染色肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponinⅠ)、结合蛋白(desmin)和α-肌动蛋白(α-SarcomericActin)为阳性。
1.4小结
CSCs可以从心肌中分离,进行体外培养增殖。并且可以在体外诱导分化为心肌细胞。
第2章心肌干细胞离子通道mRNA的表达与电流的检测由于干细胞存在致心律失常性可能,干细胞的电生理特性成为研究热点。
实验表明:CSCs分化为心肌细胞后,表现出和心室肌近似的电生理特性。然而,大鼠CSCs在未分化为心肌细胞的状态下,其离子通道表达和电生理特性尚不明了。
2.1实验目的:通过对CSCs离子通道mRNA表达和INa,Ica,Ito的检测,了解CSCs离子通道表达进程和细胞电生理特性,为以后研究提供重要的实验资料。
2.2材料和方法:取P3代CSCs,提取RNA。予以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测CSCs离子通道KCNN3,CCHL2a,Kit2.1,Kv4.3,Kv3.1,Kv2.1,Kv1.6,Kv1.3和rScn2a1的mRNA表达。膜片钳全细胞记录模式记录CSCs是否存在INa,Ica,Ito电流。
2.3结果
2.3.1 CSCs离子通道mRNA:CCHL2a强表达,Kv4.3、Kv3.1中度表达,Kv2.1、Kv1.6、Kv1.3、Kir2.1低表达,KCNN3和rScn2a1极低表达。
2.3.2膜片钳全细胞记录模式未检测出CSCs存在INa,Ica,Ito。
2.4小结
CSCs在未分化为心肌细胞的状态下,已有离子通道mRNA的表达,但是膜片钳全细胞记录模式未检测出离子电流存在。
第3章心肌干细胞移植后对大鼠心肌梗死心电生理的影响随着生物工程学发展,CSCs的发现和成功分离,使之成为新的研究热点。CSCs移植被认为是治疗心脏性疾病最好的种子细胞之一。实验也显示:CSCs移植后,对心肌梗死动物的心功能有明显的改善,但是对心电生理的影响却甚少文献报道。所以本实验旨在观察CSCs移植后对心肌梗死大鼠心电生理的影响。
3.1实验目的:观察CSCs移植后对大鼠心肌梗死心电生理的影响。
3.2材料与方法:26只雄性SD大鼠,建立心肌梗死模型,其中20只建模成功。2周后,20只心肌梗死大鼠随机分为2组,每组10只,分别为心肌干细胞移植组和对照组(PBS组)。心肌干细胞移植组大鼠予以梗死区心肌内注射CSCs(5×106/0.1 ml)0.1ml,对照组大鼠予以梗死区心肌内注射PBS0.1ml。6周后检测以下数据:心室有效不应期,心外膜单极电图激动恢复时间与激动恢复时间离散度,恶性室性心律失常诱发率,室颤阈值(VFT)和心肌梗死区、梗死边缘区CSCs缝隙连接蛋白43(Cx43)的表达。
3.3结果
3.3.1在程序电刺激S1S2,S1S2S3条件下,CSCs移植后,对心室有效不应期影响无统计学差异。
3.3.2 CSCs移植后,梗死边缘区和非梗死区的校正激动恢复时间明显缩短,校正激动恢复时间离散度明显下降。
3.3.3 CSCs移植后,心肌干细胞移植组更难诱发恶性室性心律失常。
3.3.4.CSCs移植后,梗死区、梗死边缘区和非梗死区VFT明显提高。
3.3.5CSCs移植组在大鼠梗死区和梗死边缘区都可检测到Cx43表达,并且与移植的细胞定位重叠。PBS组大鼠梗死区和梗死边缘区Cx43表达极少。
3.4小结
3.4.1 CSCs移植后,可以改善心肌梗死大鼠电生理异常状态,提高VFT。
3.4.2 CSCs移植后,能够在定植区表达Cx43。
全文结论
1 CSCs可以从心肌中分离,进行体外培养增殖。并且可以在体外诱导分化为心肌细胞。
2 CSCs在未分化为心肌细胞的状态下,已有离子通道mRNA的表达,但是膜片钳全细胞记录模式未检测出离子电流存在。
3 CSCs移植后,可以改善心肌梗死大鼠电生理异常状态,提高VFT。