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目的:本课题立足肾脾相关理论,以脾阳根于肾阳为切入点,以双侧肾上腺大部切除术建立肾阳虚证动物模型为平台,观察模型大鼠的消化吸收功能,围绕血清GAS、血清D-木糖含量,探讨细胞凋亡及凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax的表达与肾阳虚影响消化吸收功能的相关机制,并观察参附汤对肾阳虚证模型大鼠消化吸收指标的影响。运用现代研究手段检测胃窦粘膜组织、小肠粘膜吸收细胞的凋亡率,胃窦粘膜组织G细胞的表达及G细胞表达Caspase-3的百分率,小肠粘膜吸收细胞的Bcl-2、Bax表达及其超微病理形态等消化吸收相关指标,旨在从分子基因水平初步探讨肾阳虚影响消化吸收功能的可能机制。方法:本课题采用8周龄雄性SD大鼠,以双侧肾上腺大部切除方法建立肾阳虚证动物模型,并设假手术组作为对照。术后4周,将手术大鼠随机分为模型组和参附汤组。参附汤组大鼠于每天上午8:30灌胃给予参附汤水煎液(药物浓度为每ml药液含生药0.5g)1.6ml/200g体重,假手术组和模型组均灌胃给予等容量的生理盐水。共4周。实验结束时,测定实验大鼠体温,收集24小时尿液,采集血液,留取胃窦粘膜组织及小肠粘膜组织,分离、收集小肠粘膜吸收细胞进行相关指标检测:①检测24小时尿17-OH-CS含量;②检测血清GAS、D-木糖含量;③观察胃窦粘膜组织、小肠粘膜组织显微结构改变;④观察小肠粘膜吸收细胞的超微结构改变;⑤TUNEL法检测胃窦粘膜组织凋亡率、免疫组化法检测G细胞表达的平均光密度值及免疫组化双染法检测G细胞表达Caspase-3的百分率;⑥取小肠粘膜吸收细胞单细胞悬液,用流式细胞仪检测小肠粘膜吸收细胞的凋亡率;⑦免疫组化法检测小肠粘膜吸收细胞的Bcl-2、Bax蛋白表达的平均光密度。结果:①体温、24小时尿液指标检测结果:与假手术组比较,模型组大鼠体温、尿17-OH-CS含量显著降低(P<0.01);与模型组比较,参附汤组大鼠体温、尿17-OH-CS含量均显著升高(P<0.01)。②血清指标检测结果:与假手术组比较,模型组大鼠血清GAS、D-木糖含量均显著降低(P<0.01);与模型组比较,参附汤组大鼠血清GAS、D-木糖含量均显著升高(P<0.01)。③胃窦粘膜组织指标检测结果:与假手术组比较,模型组大鼠的胃窦粘膜组织变薄,细胞间隙变大,粘膜腺体有不同程度的排列紊乱、疏松、出现大量空泡样变;与模型组比较,参附汤组大鼠的胃窦粘膜组织稍厚,细胞间隙变小,腺细胞排列较规则,空泡样变减少。与假手术组比较,模型组大鼠胃窦粘膜组织的凋亡率、G细胞表达Caspase-3的百分率显著升高(P<0.01),G细胞表达的平均光密度值显著降低(P<0.01);与模型组比较,参附汤组大鼠胃窦粘膜组织的凋亡率、G细胞表达Caspase-3的百分率显著下降(P<0.01),G细胞表达的平均光密度值显著升高(P<0.01)。④小肠粘膜组织指标检测结果:光镜结果显示,与假手术组比较,模型组大鼠小肠粘膜组织厚度略欠均匀,绒毛边缘不整齐,部分上皮细胞脱落、缺失;与模型组比较,参附汤组大鼠小肠粘膜组织厚度较均匀,绒毛排列规则,上皮基本完整。电镜结果显示,与假手术组比较,模型组大鼠小肠粘膜吸收细胞微绒毛略显稀疏,细胞间连接疏松,细胞器模糊,细胞核膜内陷,异染色质凝聚、边集,胞质内空泡多见;参附汤组大鼠小肠粘膜吸收细胞超微结构较模型组情况有显著改善,细胞间连接比较紧密,胞质内空泡化结构少见,异染色质凝集、边集及核膜内陷现象均较模型组好转。免疫组化结果显示,与假手术组比较,模型组大鼠小肠粘膜组织吸收细胞Bcl-2、Bax蛋白表达均显著升高(P<0.01);与模型组比较,参附汤组大鼠小肠粘膜组织吸收细胞Bcl-2蛋白的表达显著升高(P<0.01),Bax蛋白的表达显著降低(P<0.01)。⑤小肠粘膜吸收细胞指标检测结果:与假手术组比较,模型组大鼠小肠粘膜组织吸收细胞的凋亡率显著升高(P<0.01);与模型组比较,参附汤组大鼠小肠粘膜组织吸收细胞的凋亡率显著降低(P<0.01)。结论:①采用肾上腺大部切除法建立肾阳虚证大鼠模型,模型组大鼠的一般表现符合肾阳虚的诊断标准,且模型组大鼠体温、24小时尿17-OH-CS含量均显著下降,说明肾阳虚证动物模型建立成功。②模型组大鼠血清GAS、D-木糖含量较假手术组显著下降,说明肾阳虚证模型动物的消化吸收功能下降。③模型组大鼠胃窦粘膜组织的凋亡率、G细胞表达Caspase-3的百分率显著升高,G细胞表达的平均光密度值显著降低,说明胃窦粘膜组织及其G细胞的过度凋亡影响了GAS的分泌,进而影响了模型大鼠的消化功能。④模型组大鼠小肠粘膜吸收细胞的超微组织结构改变符合凋亡细胞的典型表现,吸收细胞的凋亡率明显升高,同时,小肠吸收细胞Bax蛋白的表达显著升高,凋亡明显,凋亡与增殖失衡,使小肠粘膜吸收细胞凋亡增加,增殖不足,得不到及时更新,从而影响了模型大鼠的吸收功能。⑤温补肾阳方药—参附汤可以调节凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax的表达,从而抑制消化吸收相关组织细胞的过度凋亡,促进其更新,维护其功能,从而改善肾阳虚证模型大鼠的消化吸收功能。本课题首次采用双侧肾上腺大部切除的方法建立肾阳虚证动物模型,率先运用现代技术方法研究肾阳虚影响消化吸收功能的相关机制。肾阳虚证模型大鼠胃窦粘膜组织G细胞凋亡关键蛋白Caspase-3的表达显著增强,小肠粘膜吸收细胞的促凋亡基因Bax表达显著增强,使模型大鼠消化吸收相关组织细胞凋亡增加,功能受损,进而表现为消化吸收功能下降。温补肾阳方药—参附汤可以下调胃窦粘膜组织G细胞的Caspase-3表达、小肠粘膜吸收细胞的Bax表达,抑制过度凋亡,改善肾阳虚导致的消化吸收功能下降。由此可知,消化吸收相关组织细胞的过度凋亡可能是肾阳虚影响消化吸收功能的机制之一。