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牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)是一种可感染多种偶蹄动物的传染性病原,可引起牛病毒性腹泻/黏膜病(Bovine viral diarrhea/mucosal disease,BVD/MD),可造成严重的经济损失。天然免疫在抗病毒感染中发挥重要的作用,其与病毒间相互作用的分子机制,可以为疫病防控提供新的思路。干扰素(Interferon,IFN)系统是天然免疫的重要组成部分,而干扰素诱导蛋白是干扰素系统的效应分子,发挥直接抗病毒作用。黏病毒抵抗蛋白(Myxovirus-resistant protein,Mx)是IFN诱导抗病毒状态的关键成分,对其抗病毒作用机制的研究,有助于对病原与宿主间相互作用的认识。本文主要从BVDV与宿主相互作用的角度,围绕BVDV感染牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney cells,MDBK)前后转录组学变化及牛Mx1蛋白对BVDV感染作用的影响进行了研究,获得了以下结果。1.分离鉴定了BVDV BJ-2013株和BVDV BJ-2016株2株病毒(1)通过RT-PCR检测、细胞分离培养、间接免疫荧光等方法由牛血清和胎牛血清中分离、鉴定2株BVDV毒株,命名为BVDV BJ-2013株和BVDV BJ-2016株。利用BVDV 5’UTR序列基因型分型分析,发现BVDV BJ-2013株和BVDV BJ-2016株分别属于1a和1b基因型。(2)通过氨基酸序列比对分析和同源性比较分析,发现BVDV BJ-2013株的NS2蛋白氨基酸序列中存在12个氨基酸(LGEGNWLVNADR)的插入,BVDV BJ-2013株与BVDV 08GB44-1株的核苷酸和氨基酸同源性最高,而BVDV BJ-2016株与BVDV HJ-1株的核苷酸和氨基酸同源性最高。通过遗传演化分析,BVDV BJ-2013株与BVDV08GB44-1、Oregon株位于同一分支,亲缘关系较近;BVDV BJ-2016株与BVDV HJ-1、PJ、08GB45-2等分离毒株被分配于同一进化分支中,显示它们之间的亲缘关系较近。2.BVDV感染MDBK细胞前后转录组学的比较分析(1)通过转录组学测序技术,比较了BVDV BJ-2016株感染MDBK细胞前后不同时间的细胞转录组的变化。结果显示,共获得转录本53929条,注释到24616个基因,注释到新转录本26651条、新基因2359个。(2)通过基因差异表达分析,在Mock vs MBV 2h、Mock vs MBV 6h、Mock vs MBV12h、Mock vs MBV 24h比较组中分别筛选了1297、1732、3072、1877个差异表达基因。通过差异表达基因的GO富集分析、KEGG pathway富集分析等,发现BVDV感染细胞后引起脂质代谢相关基因的表达上调,表明BVDV感染后改变了细胞的代谢网络;发现BVDV感染细胞后引起补体和凝血级联反应信号通路中F3、C3、C1R等基因表达下调和部分具有抗病毒作用基因(如ISG15、IFITM1、Mx1等)的表达呈现显著变化,提示补体系统在BVDV感染过程中发挥重要作用,提示BVDV感染后对细胞内天然免疫的抑制有助于其感染形成。3.牛Mx1蛋白对BVDV的复制具有抑制作用(1)通过牛Mx1基因过表达慢病毒和sh RNA干扰慢病毒的感染,分别建立了Mx1基因稳定过表达和稳定敲低的MDBK细胞系。鉴定结果显示,牛Mx1基因稳定过表达细胞系中Mx1基因的表达上调5.15倍,Mx1基因稳定敲低的细胞系中Mx1基因的敲低效率达93.03%。通过BVDV分别感染Mx1基因稳定过表达和稳定敲低的细胞系,检测BVDV复制水平,结果显示,牛Mx1基因的过表达可显著抑制BVDV复制(P<0.01),而Mx1基因的敲低显著促进BVDV复制(P<0.01),表明牛Mx1蛋白对BVDV复制具有抑制作用。(2)通过在反转录过程引入非病毒序列对BVDV正负链RNA进行区分,建立了BVDV链特异性荧光定量PCR方法。通过BVDV感染Mx1基因稳定过表达和稳定敲低细胞,检测细胞内BVDV正负链RNA的变化,结果显示,Mx1基因的过表达降低了细胞中BVDV正负链RNA的含量,在BVDV感染后12～24 h间显著降低细胞内BVDV正链RNA的含量(P<0.05或P<0.01),在感染后6～36 h间,显著降低了BVDV负链RNA的含量(P<0.05或P<0.01),显示Mx1基因过表达抑制BVDV正负链RNA的复制;Mx1基因的敲低提高了细胞中BVDV正负链RNA的含量,BVDV感染后6～36 h间显著提高了BVDV负链RNA的含量(P<0.01),而BVDV正链RNA仅在BVDV感染后24～36 h呈显著提高(P<0.05),显示Mx1基因的敲低促进正负链RNA复制。结果表明,Mx1蛋白对BVDV正负链RNA的复制具有抑制作用。综上所述,本研究分离鉴定了BVDV BJ-2013株和BVDV BJ-2016株2株病毒,明确了BVDV感染MDBK细胞前后转录组学变化及其部分差异基因的作用,建立了BVDV链特异性荧光定量PCR方法,发现牛Mx1蛋白显著抑制BVDV复制及BVDV正负链RNA的复制。研究结果为解析BVDV与宿主间的相互作用和牛Mx1蛋白抗BVDV感染作用及机制提供了新的科学资料。