中药钩吻(Gelsemium elegans)是马钱科(Loganiaceae)植物胡蔓藤的全草,中医用于治疗风湿痹痛和神经痛等。近年来钩吻因其镇痛效能仅次于吗啡且无成瘾性,成为了研究的热点。然而,钩吻在临床应用中常发生中毒事件,吲哚型生物碱既是其活性成分,又是毒性成分。因此,如何减毒是钩吻安全应用需解决的关键问题。细胞色素P450酶(CYP酶)对药物的减毒有重要作用,介导着许多有毒中药的减毒机制。基于此,本论文以钩吻中的3个毒效成分(钩吻素子(KOU)、钩吻素甲(GA)及胡蔓藤碱甲(HMT))为研究对象,主要进行了钩吻生物碱的CYP酶代谢及其毒性相关性研究,旨在为揭示钩吻减毒的科学内涵,提高药物疗效和安全性提供参考依据。主要研究内容如下所述:一、钩吻生物碱的CYP酶代谢机理研究在体外肝微粒体作用下,KOU、GA、HMT分别至少生成4、5、4个代谢产物,其代谢途径相似,包括去甲基、脱氢、羟基化、去甲基脱氢与氧化。化学抑制剂及人源化重组CYP酶实验的结果表明,参与三个单体代谢的主要CYP酶亚型均为CYP3A4/5。通过小鼠腹腔注射地塞米松或酮康唑,动物体内的CYP3A4/5活性能被相应地诱导或抑制。钩吻生物碱在CYP3A4/5活性被诱导的微粒体中的代谢均显著升高,而在CYP3A4/5活性被抑制的微粒体中,其代谢率均显著降低(P<0.05),这进一步从体内证明了钩吻生物碱的主要代谢酶是CYP3A4/5。为了研究不同动物种属(人、大鼠、小鼠)的肝微粒体代谢酶对GA代谢的影响,我们分别考察了 2.5-640 μM的GA在这三种动物肝微粒体中的代谢速率。首先通过大鼠灌胃给药GA,收集尿液粪便,处理分离纯化得到其主要代谢产物,经核磁共振鉴定为4-N-去甲基GA。用4-N-去甲基GA的含量变化表示GA在肝微粒体中的代谢速率,结果表明,GA在三种动物肝微粒体中的代谢均符合经典米式方程,代谢速率快慢依次为:人肝微粒体(705.6±36.2 pmol/mg/min)>小鼠肝微粒体(632.1 ±16.0 pmol/mg/min)>大鼠肝微粒体(229.1 ±15.9 pmol/mg/min)。这表明GA的体外代谢有显著性种属差异。为了考察HMT在大鼠体内的处置特征,本研究建立了灵敏的UPLC-MS/MS检测方法,并计算了 HMT在大鼠体内的药代动力学参数。HMT在大鼠体内吸收迅速,口服给药HMT12.50±2.74min后,其血药浓度达到峰值(Cmax 28.49±6.65nmol/L),消除半衰期(T1/2)为82.22±35.55min。我们推测其血药浓度的迅速降低与药物代谢酶的代谢作用密切相关。二、钩吻生物碱的CYP酶代谢与其毒性相关性研究首先,采用MTT法测定了钩吻生物碱对L-02人正常肝细胞的增殖毒性,结果表明,KOU和GA在较高浓度(600-800 μM)时对L-02细胞的增殖有不同程度的抑制作用(P<0.001)。而HMT对L-02细胞增殖有明显的抑制作用,并呈现剂量依赖性(P<0.001)。其次,给小鼠腹腔注射酮康唑(KET),形成体内CYP3A4/5活性抑制的模型。实验组小鼠给予腹腔注射KET四天后,再灌胃给予钩吻生物碱;对照组小鼠直接灌胃给予相同剂量的钩吻生物碱。结果表明,对照组小鼠并未出现死亡;而实验组小鼠在14天内的生存率降低至0%(GA)和20%以下(HMT)。这表明抑制CYP3A4/5活性,钩吻生物碱的毒性显著增加。最后,为了进一步考察CYP酶代谢对GA毒性的作用,我们分别给予斑马鱼相同浓度的GA及代谢物4-N-去甲基GA。结果显示,GA的浓度为750 μM时,斑马鱼有部分死亡,出现明显的毒性反应;而相同浓度下,代谢物4-N-去甲基GA对斑马鱼则无毒性反应。经计算,GA及代谢物对斑马鱼的半数致死浓度分别为0.81和7.42 mg/mL。该结果表明经CYP酶代谢后,GA转化成为毒性更小的代谢物。综上所述,本研究首次证明钩吻生物碱在人、鼠肝微粒中的代谢途径主要为去甲基、脱氢、羟基化、去甲基脱氢和氧化反应,且参与其最主要的代谢酶亚型为CYP3A4/5。同时证明钩吻生物碱经过CYP3A4/5代谢后,毒性显著降低。本研究结果可为钩吻生物碱的毒性预警及临床安全应用提供理论依据。