背景和目的：流行性感冒,简称流感,是由流感病毒感染引起的一种急性呼吸道传染病,严重危害人类健康。全球性的流感大流行危害性尤为严重,甲型流感病毒曾引起了多次大范围的流行,造成了全球巨大的人力资源和物力资源的损失,极易造成社会动荡。流感疫苗是防治流感大流行的有效手段。目前常用的流感疫苗主要分为两类：灭活疫苗与减毒活疫苗。相比之下减毒活疫苗更有优势,①它通过同自然感染相似的鼻腔免疫,同时激发局部粘膜免疫以及机体的体液、细胞免疫反应,作用时间长。②减毒活疫苗可以通过滴鼻途径给药,避免了注射途径带来的问题。③可提供有效的交叉免疫保护。传统的冷适应流感减毒活疫苗制备过程复杂,耗时长,难以满足流感大流行时疫苗的需求。研发安全、高效、易于生产的减毒活疫苗是新型流感疫苗的发展方向。microRNA (miRNA)介导的流感弱毒株快速构建方法具有良好的前景。本课题利用microRNA介导的基因沉默机制设计一种全新的病毒减毒策略。microRNA (miRNA)是一类进化上保守的非编码小分子RNA,与其靶序列的结合,可抑制其翻译。并且miRNA的分布具有组织特异性。根据上述两个特点,将miRNA的结合靶位装载进病毒基因组,在病毒感染宿主细胞的过程中,内源性miRNA与其靶序列结合,抑制病毒RNA在特定组织的翻译及病毒的增殖,从而导致减毒。本课题组前期选择肺组织内源性高表达的let-7b作为靶向miRNA,将其结合靶位装入南京2009甲型H1N1流感病毒株(A/Nanjing/108/2009 H1N1)的RNA聚合酶复合物中的PB1片段编码区,并采用反向遗传学方法拯救出重组流感病毒miRT-H1N1。在体外实验中研究发现miRT-H1N1在miR-let-7b高表达的人支气管上皮细胞中(human bronchial epithelial cell line HBE)复制受限,毒力下降。miR-let-7b通过与其靶序列的结合,抑制miRT-H1N1的PB1合成从而抑制miRT-H1N1的复制。本课题组前期研究在细胞水平上证实了miRT-H1N1的减毒作用,但miRT-H1N1是否可成为有效的流感病毒减毒株,还需要通过动物模型体内实验进行验证。我们选用Balb/c小鼠进行动物实验。其优点在于：小鼠的生理生化和发育与人类相似；遗传背景均一,试验结果精确可靠；与鼠相关的细胞因子等试剂已商品化；有研究证明Balb/c小鼠对高致病性的流感病毒易感性高,2009新型H1N1病毒可在Balb/c小鼠内复制,不需要培养预适应株,可作为流感候选疫苗评价的动物模型。本研究的目的就是通过鼻腔免疫BALB/c小鼠的方法验证miRT-H1N1是否在小鼠体内实现减毒,初步评估其安全性。然后从体液免疫、细胞免疫、粘膜免疫三个方面研究miRT-H1N1的免疫原性,并评价miRT-H1N1对小鼠的免疫保护性。为microRNA介导的流感病毒减毒活疫苗的研发奠定基础。方法：1.miRT-H1N1的致病力研究应用血凝试验测定三种病毒miRT-H1N1、scbl-H1N1和wt-H1N1的血凝素(HA)效价,并用组织细胞培养法检测这三种病毒在鸡胚中的半数组织细胞培养物感染量(TCID50)。选用6周龄BALB/c雌性小鼠为动物模型,按病毒种类(miRT-H1N1、 scbl-H1N1和wt-H1N1)及不同梯度剂量分组,每组10只,PBS对照组每组5只。将各个稀释度(107TCID50～103TCID50)病毒液滴鼻感染小鼠,连续观察14天,记录体重变化和死亡情况,Reed-Muench法计算小鼠MLD50。将12只6周龄BALB/c雌性小鼠随机分为3组(miRT-H1N1组、scbl-H1N1、wt-H1N1),每组4只,经鼻滴入105TCID50病毒液,分别于感染后第3、5天取肺组织,检测病毒载量。感染第3天,取小鼠肺组织,抽提其病毒RNA,用RT-PCR法扩增miRT-H1N1和WT-H1N1的PB1基因片段,送检测序。2. miRT-H1N1的免疫原性研究将6周龄BALB/c雌性小鼠随机分为miRT-H1N1组和PBS对照组,每组6只,第1次免疫后28天加强免疫1次。采集第一次免疫后28天,第二次免疫后14天小鼠血清,应用血凝抑制试验(HI)、病毒中和试验(MN)和免疫酶联吸附试验(ELISA),分别测定血凝抑制抗体、血清病毒中和抗体和血清抗体IgG。采集第2次免疫后14天鼻腔、肺脏冲洗液,经ELISA测定分泌性抗体(sIgA)。采集第2次免疫后14天小鼠脾细胞悬液,经ELISA测定IFN-y和IL-4水平。3. miRT-H1N1的免疫保护性研究将6周龄BALB/c雌性小鼠随机分为miRT-H1N1组和PBS对照组,每组12只,免疫方法同前。在第二次免疫后14天通过滴鼻方式给予100LD50的H1N1流感病毒进行攻毒实验。其中6只观察小鼠14天内体重变化及存活率,另外6只小鼠于攻毒第3,5天处死,采集小鼠肺组织病理切片HE染色观察病理变化,参照Cimolai等的病理评分系统行肺组织病理评分IPS (Histopathologic Score)。并用组织细胞培养法检测肺组织病毒载量。RT-PCR法检测攻毒第3、5天小鼠肺组织炎症细胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ水平。结果：1.miRT-H1N1的致病力研究(1)体外实验中,三种病毒miRT-H1N1、scbl-H1N1及WT-H1N1的血凝素(HA)效价分别为1：29、1：28、1：28。鸡胚中培养的miRT-H1N1病毒滴度与WT-H1N1, scbl-H1N1的相似,三组间差异无统计学意义。(2)小鼠体重变化及半数致死量：成功构建了2009甲型H1N1流感病毒株(A/Nanjing/108/2009 H1N1)感染BALB/c小鼠模型。实验观察到WT-H1N1组小鼠自感染病毒第3天开始出现反应迟钝,食欲减退,体重下降等症状,第5至8天小鼠体重陆续下降超过原始体重的25%,实施安乐死,其中107TCID50剂量组全部死亡。与之相反,感染miRT-H1N1的小鼠活动基本正常,即使感染最高剂量(107TCID50)的miRT-H1N1,小鼠体重下降也不明显(<10%),没有出现死亡,即LD50>107TCID50。 WT-H1N1与scbl-H1N1组的半数致死量相似,分别为105.3TCID50,105.38 TCID50。(3)小鼠肺组织病毒载量：在感染第3、5天小鼠的肺组织内均可分离出病毒,感染第3天wt-H1N1组的病毒滴度与scb1-H1N1组相似,分别为10537TCID50/g,105.49 TCID50/g,而miRT-HlN1组的病毒滴度为103.50 TCID50/g,明显低于野毒株(P<0.05)。感染第5天,三组病毒滴度有所下降,分别为103.71、103.49、101.5 TCID50/g,与wt-H1N1组、scbl-H1N1组相比,miRT-H1N1组的病毒滴度明显降低,下降超过100倍(P<0.05)。用RT-PCR法扩增小鼠肺组织中miRT-H1N1和WT-H1N1的PB1基因片段,电泳结果显示扩增到了特异性的目的条带,测序确认重组突变病毒miRT-H1N1包含突变目标序列,未发现有病毒逃逸突变体。2. miRT-H1N1的免疫原性研究(1) miRT-H1N1免疫后小鼠体液免疫应答效果：miRT-H1N1滴鼻免疫BALB/c小鼠28天后即可刺激小鼠机体产生较高水平的血1gG、HI和病毒中和抗体,抗体几何平均滴度分别为905、403、227,二免14天小鼠体内血清抗体滴度达到最高,分别为2873、2032、313,与PBS对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。第2次免疫后小鼠血清1gG、HI水平较第1次免疫后明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。(2) miRT-H1N1免疫后小鼠粘膜免疫应答效果：1niRT-H1N1免疫的小鼠鼻冲洗液和肺冲洗液均可检测到sIgA,抗体几何平均滴度分别为16、64,而PBS对照组的sIgA<10,两组差异有统计学意义(P<0.05)。(3) miRT-H1N1免疫后小鼠细胞免疫应答效果：予以miRT-H1N1 2次免疫小鼠后,特异性HA抗原与免疫小鼠脾淋巴细胞共培养上清测定IFN-γ、IL-4结果显示,PBS对照组小鼠IFN-γ、IL-4两种细胞因子的浓度很低,分别为17.4pg/ml、24.1pg/ml,而miRT-H1N1组用HA刺激后,IFN-γ、IL-4分别达到了54.5pg/ml、70.9pg/ml,差异有统计学意义(P<0.05),提示miRT-H1N1在小鼠体内能够同时诱导Thl和Th2细胞免疫应答。3. miRT-H1N1的攻毒保护性研究(1)攻毒实验中小鼠体重变化及生存率：同源流感病毒wt-H1N1攻毒后第2天开始,用PBS免疫的小鼠即开始出现食欲减退,活动减少等症状,体重下降明显,最低下降到原体重的72.5%,下降程度超过原始体重的25%,对小鼠实施安乐死,至攻毒第8天,小鼠全部死亡,存活率为0。与之相反,用miRT-H1N1免疫的小鼠活动基本正常,体重轻度下降,攻毒第8天后体重恢复至初始体重,存活率达到了100%。(2)攻毒后小鼠肺组织病毒载量、病理及炎症因子变化：攻毒第3天,miRT-H1N1组小鼠肺组织病毒滴度为101.53 TCID50/g,明显低于PBS对照组的105.13 TCID50/g (P<0.05)。攻毒第5天,PBS对照组小鼠肺组织病毒滴度下降至103.8TCID50/g,而miRT-H1N1组小鼠肺组织中未分离出病毒。攻毒第5天,PBS组小鼠肺组织出现了严重的病理改变,包括肺泡结构塌陷,坏死性支气管炎,组织广泛出血等,相比之下,miRT-H1N1组小鼠肺组织只有轻微的组织病理变化。与之一致的是PBS对照组小鼠肺组织病理学评分高达20.3,而miRT-H1N1组小鼠肺组织病理学评分仅为7.3,差异有统计学意义(P<0.05)。攻毒第3天miRT-H1N1组小鼠肺组织炎症因子IL-6, TNF-α, IFN-β的mRNA相对表达量分别为(2.6±0.8,2.4±0.4,10.6±4.7),低于PBS对照组(10.7±1.6,4.4±1.1,39.7±15.5)(P<0.05)。攻毒第5天小鼠体内相关炎症反应有所减弱,miRT-H1N1组小鼠肺组织IL-6, TNF-α, IFN-β的mRNA相对表达量分别为(1.5±0.3,1.3±0.1,2.3±0.6),低于PBS对照组(4.0±1.2,3.0±0.9,2.3±0.6)(P<0.05)。结论：1.miRT-H1N1在BALB/c小鼠肺组织中的毒性较WT-H1N1、scb1-H1N1显著减弱,其致病力较野毒株明显降低。表明了microRNA介导甲型H1N1流感减毒株在小鼠体内的安全性。但是miRT-H1N1在鸡胚中的生长特性却与野毒株相同,表明miRT-H1N1可以在体外采用鸡胚培养的方式大量制备。2. miRT-H1N1具有良好的免疫原性,可诱导小鼠产生较强的体液免疫、粘膜免疫及细胞免疫反应,从而产生有效的免疫保护效果,完全保护小鼠抵抗流感病毒的攻击。本研究为microRNA介导流感减毒疫苗的深入研究奠定了基础。