嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法已在肿瘤免疫细胞疗法中得到广泛应用,并在治疗恶性血液肿瘤中展现出良好的临床效果。然而现有的CAR-T细胞制备工艺主要基于慢病毒系统,存在病毒随机插入、致瘤风险、生产成本高昂等问题。另外,CAR-T细胞过度激活后面临的细胞耗竭以及实体瘤中强大的免疫抑制微环境都限制了 CAR-T细胞疗法治疗效果的进一步提高和推广。因此,开发全新的CAR-T制备工艺、降低CAR-T细胞耗竭、提高肿瘤尤其是实体肿瘤的治疗效果成为目前研究的热点。本论文尝试开发一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的新型CAR-T制备工艺,在不依赖传统病毒导入系统的基础上,实现CAR基因的定点整合和特定基因的敲除,从而提高CAR-T细胞的安全性和有效性。人REGNASE-1是一种锌指核糖核酸酶,可通过降解控制免疫细胞活化的mRNA来调节免疫稳态,已有研究报道REGNASE-1的缺失能够改善T细胞耗竭及功能持久性。因此,我们拟通过优化的电转导方法将CD19 CAR元件定点插入到人REGNASE-1基因的特定位点,一步实现CAR基因的定点整合和REGNASE-1基因的敲除,构建CAR元件稳定表达、T细胞耗竭降低、抗肿瘤功能增强的新型CAR-T细胞,并进行全面的抗肿瘤活性评价。首先我们利用Xfect化学转染法初步筛选靶向REGNASE-1的sgRNA,并利用电转导方法在人T细胞中进行验证,最终筛选出一条将外源CD19 CAR元件高效定点整合到REGNASE-1基因的sgRNA。在此基础上,我们利用优化的电转导方法一步构建出非病毒REGNASE-1定点整合CD19 CAR-T细胞（REGNASE-1-19bbz）,并与慢病毒系统制备的 CD19 CAR-T 细胞（LV-19bbz）同时进行体内、外功能评价。结果显示,该方法构建的REGNASE-1-19bbz中CAR阳性率最高可达31%（平均21%）。同时REGNASE-1-19bbz具有与LV-19bbz相似的存活率及扩增能力,并且在肿瘤抗原的持续刺激下表现出更持久的增殖能力。而且REGNASE-1-19bbz能够迅速响应肿瘤细胞的刺激,调控表面标志物的表达、促进T细胞记忆亚群的分化、增加细胞因子的分泌,进而有效行使抗肿瘤功能。之后我们通过乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性实验及多轮肿瘤细胞刺激实验在体外证明了 REGNASE-1-19bbz与LV-19bbz相比具有更强的肿瘤杀伤能力。另外,通过流式细胞分析发现,REGNASE-1-19bbz中维持增殖及记忆相关的关键转录因子BATF和TCF-1的表达显著提高,进一步从分子机制层面上证明了 REGNASE-1敲除对于REGNASE-1-19bbz持久增殖及抗肿瘤功能的重要作用。最后,我们通过小鼠体内实验证明了 REGNASE-1-19bbz细胞能够在动物体内维持较长时间的抗肿瘤活性,具有更强的肿瘤杀伤作用及肿瘤清除能力。综上所述,本论文通过体内外的功能评价证实了利用CRISPR/Cas9基因编辑工具通过电转导方法一步构建非病毒REGNASE-1定点整合CAR-T细胞的可行性及有效性。在不依赖病毒载体的情况下将CAR元件定点整合到基因组的特定位点,避免了基因随机插入带来的安全隐患,提高了 CAR-T细胞的均一性。通过人REGNASE-1基因的敲除促使REGNASE-1-19bbz细胞中CAR-T细胞的耗竭显著降低,持续扩增能力以及体内外的抗肿瘤作用显著增强,具有潜在的应用前景。本论文的研究也为现有CAR-T细胞的制备技术和功能改善提供了新的思路及方法。