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第一部分:急性支气管哮喘Tyro3表达情况目的:明确急性支气管哮喘Tyro3表达变化情况。方法:1、严格依照纳入与排除标准通过自动化乳胶免疫测定法分析哮喘急性发作期患者与健康志愿者外周血血清中Tyro3的表达水平。2、通过OVA腹腔注射致敏后雾化吸入激发的方法构建Balb/c小鼠急性哮喘模型,设立空白对照组,采用HE、Masson、AB-PAS染色法明确肺组织病理改变,IF检测肺组织Tyro3表达情况,ELISA测定血清Ig E及Tyro3、BALF上清Tyro3含量。结果:1、哮喘急性发作期患者血清Tyro3水平显著低于健康志愿者（P＜0.001）;2、与空白对照组相比,急性哮喘小鼠血清Ig E含量显著增高（P＜0.001）,肺组织炎细胞浸润、杯状化生、黏蛋白分泌、气道平滑肌纤维增生及支气管周围胶原沉积,模型构建成功。其肺组织Tyro3、血清（P=0.002）及BALF上清（P=0.003）Tyro3含量均显著低于空白对照组。结论:与对照组相比,急性支气管哮喘Tyro3表达降低。第二部分:BMMSCs干预对急性哮喘小鼠Tyro3表达的影响目的:探究BMMSCs干预急性哮喘对Tyro3表达的影响。方法:1、分离、培养并鉴定原代BMMSCs:小鼠骨髓提取培养并进行形态学、表面标志物、成脂成骨分化潜能鉴定。2、明确BMMSCs缓解急性哮喘病情:将Balb/c小鼠随机分为空白对照组、哮喘模型组、MSCs干预哮喘组、MSCs对照组。OVA腹腔致敏后雾化激发,BMMSCs混悬液尾静脉注射干预后,予临床症状评分,ELISA检测血清Ig E、BALF上清中Th2型炎症因子及抑炎因子IL-10含量,HE、AB-PAS、Masson染色观察肺组织病理变化。3、检测BMMSCs对哮喘小鼠Tyro3表达水平的影响:RT-PCR检测肺组织Tyro3m RNA含量,免疫组化、免疫荧光、Western Blot检测肺组织Tyro3蛋白表达水平。ELISA分析血清、BALF上清中Tyro3蛋白含量。1、成功分离培养BMMSCs。2、BMMSCs明显改善急性哮喘小鼠病情:2.1与哮喘模型组相比,MSCs干预哮喘组小鼠临床症状评分减低,血清Ig E、BALF中Th2相关细胞因子含量降低（IL-4:P＜0.001;IL-5:P=0.002;IL-13:P=0.005）,IL-10升高。2.2 BMMSCs干预后肺组织病理改善,炎性细胞浸润、胶原纤维及平滑肌增生减轻,杯状化生及黏液分泌减少。2.3与哮喘模型组相比,BMMSCs干预后,肺组织Tyro3 m RNA含量增高（P=0.035）,肺组织（P=0.032）、BALF上清（P=0.043）、血清（P=0.009）中Tyro3蛋白表达水平增高。结论:BMMSCs显著抑制哮喘小鼠肺内Tyro3表达下调。第三部分:Tyro3在BMMSCs干预哮喘中的作用及机制研究目的:探讨Tyro3在BMMSCs干预哮喘中的重要作用。方法:1、构建腺病毒Ad-sh Tyro3干扰载体,在体敲低肺组织中Tyro3表达水平,以空载腺病毒Ad-NC为对照,另外依据OVA/BMMSCs干预方式,将Balb/c小鼠随机分为8个分组:空白对照组（Ad-NC）、空白对照组（Ad-sh Tyro3）、哮喘模型组（AdNC）、哮喘模型组（Ad-sh Tyro3）、MSCs干预哮喘组（Ad-NC）、MSCs干预哮喘组（Ad-sh Tyro3）、MSCs对照组（Ad-NC）、MSCs对照组（Ad-sh Tyro3）。通过小动物成像、冰冻切片免疫荧光观察肺部腺病毒转染情况。2、分析腺病毒转染后小鼠肺组织Tyro3表达水平的变化:通过RT-PCR检测肺组织Tyro3 m RNA含量,免疫组化、免疫荧光、Western Blot检测肺组织Tyro3蛋白表达水平。ELISA分析血清、BALF上清中Tyro3蛋白含量,综合分析Ad-sh Tyro3转染对小鼠Tyro3表达水平的影响。3、评估Tyro3在BMMSCs改善急性哮喘中的地位:在体敲减Tyro3后采用ELISA测定哮喘相关炎症因子变化情况、病理评估哮喘严重程度。4、初步探讨Tyro3参与BMMSCs干预哮喘的作用机制采用流式细胞术分析肺组织免疫细胞嗜酸性粒细胞占比、表达Tyro3的免疫细胞类型及表达量、DCs占比及活化情况、纵隔淋巴结CD4+T细胞活化情况。结果:1、成功构建腺病毒载体并感染肺组织,未感染心脏、肝、脾、肾。2、Ad-sh Tyro3转染成功降低小鼠肺组织、血清、BALF上清中Tyro3表达水结果:平:哮喘模型组和MSCs干预哮喘组中,同一组间注射Ad-sh Tyro3较注射Ad-NC的小鼠肺组织Tyro3 m RNA含量显著降低（哮喘模型组Ad-NC vs Ad-sh Tyro3:P=0.008;MSCs干预哮喘组Ad-NC vs Ad-sh Tyro3:P=0.040）,肺组织（哮喘模型组Ad-NC vs Ad-sh Tyro3:P=0.056;MSCs干预哮喘组Ad-NC vs Ad-sh Tyro3:P＜0.001）、BALF上清（哮喘模型组Ad-NC vs Ad-sh Tyro3:P＜0.001;MSCs干预哮喘组Ad-NC vs Adsh Tyro3:P=0.043）、血清（哮喘模型组Ad-NC vs Ad-sh Tyro3:P=0.043;MSCs干预哮喘组Ad-NC vs Ad-sh Tyro3:P=0.035）中Tyro3蛋白表达水平显著降低。免疫组化、免疫荧光亦可观察到同一组间注射Ad-sh Tyro3较注射Ad-NC小鼠肺组织Tyro3含量降低。3、敲减肺组织Tyro3表达水平后哮喘模型小鼠病情加重,BMMSCs干预哮喘效果减弱:敲减Tyro3之后,较同一组间未敲减Tyro3的小鼠相比,哮喘模型组及MSCs干预哮喘组两组小鼠血清Ig E含量（哮喘模型组Ad-NC vs Adsh Tyro3:P=0.03;MSCs干预哮喘组Ad-NC vs Ad-sh Tyro3:P＜0.001）、BALF上清IL-4（哮喘模型组Ad-NC vs Ad-sh Tyro3:P＜0.001;MSCs干预哮喘组Ad-NC vs Adsh Tyro3:P＜0.001）、IL-5（哮喘模型组Ad-NC vs Ad-sh Tyro3:P＜0.001;MSCs干预哮喘组Ad-NC vs Ad-sh Tyro3:P＜0.001）、IL-13（哮喘模型组Ad-NC vs Adsh Tyro3:P＜0.001;MSCs干预哮喘组Ad-NC vs Ad-sh Tyro3:P=0.140）含量升高,IL-10含量显著降低（哮喘模型组Ad-NC vs Ad-sh Tyro3:P=0.014;MSCs干预哮喘组AdNC vs Ad-sh Tyro3:P=0.003）。哮喘模型组和MSCs干预哮喘组中,同一组间注射Adsh Tyro3较注射Ad-NC的小鼠肺组织炎性细胞浸润、胶原纤维及平滑肌增生加重,杯状化生及黏液分泌增多。4、敲减Tyro3之后,与未敲减Tyro3的小鼠相比,哮喘模型组及MSCs干预哮喘组两组小鼠纵隔淋巴结表达CD69的CD45+CD3+CD4+T细胞占比（哮喘模型组AdNC vs Ad-sh Tyro3:P=0.001;MSCs干预哮喘组Ad-NC vs Ad-sh Tyro3:P＜0.001）、纵隔淋巴结CD45+CD3+CD4+T细胞CD69 MFI水平（哮喘模型组Ad-NC vs Adsh Tyro3:P＜0.001;MSCs干预哮喘组Ad-NC vs Ad-sh Tyro3:P＜0.001）、肺组织免疫细胞中嗜酸性粒细胞占比（哮喘模型组Ad-NC vs Ad-sh Tyro3:P=0.009;MSCs干预哮喘组Ad-NC vs Ad-sh Tyro3:P=0.023）、肺组织中表达Tyro3的DCs占比（哮喘模型组Ad-NC vs Ad-sh Tyro3:P＜0.001;MSCs干预哮喘组Ad-NC vs Ad-sh Tyro3:P＜0.001）、肺组织总CD45+细胞中DCs的占比（哮喘模型组Ad-NC vs Ad-sh Tyro3:P＜0.001;MSCs干预哮喘组Ad-NC vs Ad-sh Tyro3:P＜0.001）、肺组织中DCs的CD80 MFI水平（哮喘模型组Ad-NC vs Ad-sh Tyro3:P＜0.001;MSCs干预哮喘组Ad-NC vs Adsh Tyro3:P=0.001）及MHCII MFI水平（哮喘模型组Ad-NC vs Adsh Tyro3:P＜0.001;MSCs干预哮喘组Ad-NC vs Ad-sh Tyro3:P＜0.001）均显著增高,DCs的Tyro3 MFI水平显著降低（哮喘模型组Ad-NC vs Ad-sh Tyro3:P=0.001;MSCs干预哮喘组Ad-NC vs Ad-sh Tyro3:P＜0.001）。小鼠肺组织免疫细胞中只有DCs能表达Tyro3,且与空白对照组相比,哮喘模型组小鼠肺组织细胞表达Tyro3的DCs占总DCs数量的比例降低（Ad-NC空白对照组vs哮喘模型组:P＜0.001;Ad-sh Tyro3空白对照组vs哮喘模型组:P＜0.001）,BMMSCs干预后增加（Ad-NC空白对照组vs哮喘模型组:P＜0.001;Ad-sh Tyro3空白对照组vs哮喘模型组:P＜0.001）,而其它免疫细胞不表达Tyro3。非免疫细胞尽管也表达Tyro3,但其水平在不同处理组间无明显差异（P＞0.05）。结论:DCs的Tyro3表达增高参与了BMMSCs干预急性哮喘的过程。