论文部分内容阅读
果树嫁接无性繁殖时,砧木会对接穗的树形、抗性、果实品质等产生影响。这种影响除了与生理结构、激素和营养运输等有关外,还与mRNA等大分子物质远距离传递有关。目前有关mRNA韧皮部远距离传递机理在草本植物上取得了一定的进展,但是对于多年生木本植物的果树来说,研究进展缓慢。本研究以杜梨(Pyrus betulaefolia Bunge)为试验材料,通过环剥、嫁接等园艺措施结合现代生物学技术手段克隆鉴定获得一个具有韧皮部远距离传递功能的WUSCHEL-RELATEDHOMEOBOX mRNA,并且能够对植株形态产生影响；体外互作、共转基因后嫁接实验等证明该基因mRNA与多聚嘧啶结合(PTB)蛋白结合在韧皮部远距离传递。其主要研究结果如下：1、结合基因组,从杜梨中克隆获得12个WOX基因C1-C12; NCBI-blast和SMART结构分析发现C1-C12均具有典型的Homedomain结构域,其中C6具有4个未知的LCR区,与其他成员结构不同。RT-PCR分析显示,C6在根、茎尖、叶片和韧皮部中轻微表达；聚类分析发现C6与拟南芥WUS基因聚在一起,但C6结构与AtWUS结构略有不同,加之,后续研究证明C6具有远距离传递能力,故将C6命名为PbWoxT1.2, PbWoxT1基因全长1286bp,分子量约为36KD；1年生杜梨茎原位杂交结果显示,PbWoxT1在韧皮部筛管伴胞中表达较强；PbWoxT1-GFP载体基因枪轰击洋葱表皮及PEG转化玉米原生质体瞬时表达结果显示PbWoxT1主要定位在细胞核中,并在细胞膜上呈不规则点状聚集。超表达PbWoxT1能够使烟草形态发生变化：叶片上表皮绒毛增多,个别叶片变为勺子状；茎部发生扭曲,呈不规则形；主根消失,侧根生长旺盛。但这些症状会随着植株生长逐渐消失。3、对杜梨侧枝进行两道环剥后利用RT-PCR对韧皮部中PbWoxT1检测发现,PbWoxT1信号会由于韧皮部集流的阻断而消失,初步推测韧皮部中的PbWoxT1可能由其他部位运输而来；在对3年生杜梨实生苗进行不同环剥处理发现,PbWoxT1主要在侧枝、主干顶部以及根部合成后随着韧皮部集流进行远距离运输,在韧皮部中不合成PbWoxT1;利用CAPs分析‘鸭梨’微嫁接杜梨体系以及2年生的‘鸭梨’/杜梨植株进行鉴定发现,在‘鸭梨’/杜梨内,PbWoxT1能够通过韧皮部进行双向传递。4、为了进一步确定PbWoxT1具有远距离传递性,选用35S启动子驱动PbWoxT1全长融合GFP进行烟草转基因,野生型烟草与转基因烟草不同组合嫁接30d后对野生型接穗或砧木进行RT-PCR检测确定PbWoxT1具有双向传递的能力；并且转基因植株为砧木能够使得野生型接穗花柱变长。5、根据PbWoxT1结构域将其删减成不同片段来确定PbWoxT1主要传递区域,在伴胞特异启动子CoYMv驱动下进行烟草转基因,以野生型植株为接穗转基因植株为砧木进行嫁接, RT-PCR检测接穗中PbWoxT1片段的传递信号,统计发现：包含PbWoxT1234-781区域的片段均具有传递性,PbWoxT1174-384(低于50%)、PbWoxT1680-1286不传递。MEME分析删减片段发现,CTCT多聚嘧啶结构区为传递片段特有区域。6、多聚嘧啶结合(PTB)蛋白能够与RNA上CUCU结构区特定结合。根据基因组分析在杜梨中克隆得到3个PTB蛋白,聚类分析发现PbPTB3与CmRBP50同源性较近,且具有4个RRM区且定位于细胞核和细胞质中,与PbPTBl和PbPTB2有所不同。]tNA-Protein Pull-down实验发现,PbPTB3蛋白能够与可远距离传递的PbGAI, PbWoxT1都能结合,而PbPTB1蛋白和PbPTB2只能与其中一个传递RNA结合。因此,我们对PbPTB3在mRNA韧皮部远距离传递中的作用进行进一步研究。7、免疫定位分析发现PbPTB3在杜梨茎部伴胞中表达强烈。利用伴胞特异启动子SUC2驱动PbPTB3融合1nCherry进行烟草转基因,与野生型接穗嫁接30d后,Western blot鉴定发现在野生型接穗中能检测到融合蛋白。说明伴胞中产生的PbPTB3蛋白通过嫁接口进行了传递；选育PbWoxT1和PbPTB3单转和双转基因烟草植株,进行不同组合嫁接,鉴定发现：PbPTB3能够促进PbWoxT1在嫁接体系中传递量和传递率的增加,说明PbPTB3在PbWoxT1mRNA韧皮部远距离传递过程中起重要作用。综上所述,我们认为PbWoxT1作为一个新发现的可通过韧皮部远距离传递mRNA,能够在伴胞中与PbPTB3以及其他一些非细胞自治蛋白形成一个RNP复合体,这个复合体在韧皮部集流的推动下通过嫁接口进行远距离移动,进而对树形发育、树势平衡进行调控。