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PKB(Protein Kinase B:蛋白酶B)是与PKC结构同源的Ser/Thr蛋白激酶,具有促进细胞增殖,抵抗细胞脱落凋亡的生物学效应。PH结构域(pleckstrin homology domain)是蛋白分子内由约120个氨基酸组成的保守序列,可介导蛋白分子之间的相互识别、结合,进而影响蛋白激酶对底物蛋白分子的活化水平。有研究提示,PKB分子的活化是通过蛋白分子的PH结构域与胞浆膜PDK(phosphoinostide depent protein kinase:磷脂酰肌醇依赖性蛋白激酶)分子的结合、催化而激活的,本实验即研究:①PDK分子对PKB分子的磷酸化调控作用;②PDK影响PKB分子活化后的宿主细胞生物学功能改变的特点。 实验中,构建了PDK分子PH结构域原核表达载体pRSETB-PDK PH,褪皮素(RxR)诱导表达的真核表达载体pIND(SPI)-pVgRxR-PDK PH,腺病毒质粒Ad-PDK PH三个表达载体,分别进行了原核蛋白表达,哺乳动物细胞(人胃癌细胞SGC7901)的稳定转化和裸鼠体内的治疗实验,根据实验所得原核蛋白表达、真核细胞稳定转染后RT-PCR、DNAladder、FCM、Western Blotting和裸鼠体内治疗实验结果,可以明确: 1.PDK PH结构域的原核表达质粒pRSETB-PDK PH可在E-ColiJM 109(DE3)中稳定表达可溶蛋白。 2.实验结果证实,转染了目的基因PKD PH Domain cDNA序列的人胃癌细胞株SGC7901在外源刺激IGF(胰岛素类生长因子)存在和目的基因诱导表达剂RXR诱导下,可在真核表达载体pIND(sPI)中稳定表达目的蛋白并发挥作用。 3.胰岛素或生长因子诱导的真核细胞生化活动过程中,PDK分子PH结构域在真核细胞中的过表达可以引起细胞尤其是肿瘤细胞的凋亡形为,随着PDK分子PH结构域蛋白表达水平的逐步提高,凋亡形为逐步增强。 4.在胰岛素或生长因子诱导的细胞生化活动过程中,PDK分子PH结构域在真核细胞中的过表达可以引起PKB分子磷酸化水平的降低,说明PKB分子的磷酸化活化受PDK分子的调控,两者呈反相相关关系。 5.PDK分子PH结构域目的蛋白的过表达引起的细胞凋亡的机制主要是下调了起抵抗细胞凋亡作用的PKB分子的磷酸化水平,从而降低其活性,无法发挥积极的生化作用。