目的:甘草次酸（Glycyrrhetinic acid,GA）是甘草酸制剂在体内代谢的活性产物,具有保肝、抗肝炎及抗肝癌等作用。由于GA在水中的溶解度低及生物利用度不高,此外,GA可引起钠潴留及钾流失等不良反应。为了解决GA目前存在的问题及提高疗效,研究者致力于研究纳米给药系统以减少药物副作用和保持药物的有效浓度。与纳米给药系统的其它制剂比较,脂质体具有良好的细胞亲和力,组织相容性和不引起免疫抑制等特点。脂质体作为药物被动靶向的载体,在体内易被网状内皮系统摄取,若考虑对脂质体的表面进行特异性修饰,靶向配体修饰脂质体可有效提高GA传送至肝病变细胞,达到主动靶向作用。研究已证实了肝内皮细胞和树突细胞存在丰富的甘露糖受体,甘露糖受体的碳水识别区域可特异性识别并结合末端含甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺和海藻糖残基的化合物。因此,针对甘露糖受体及脂质体特点,设计一种可被甘露糖受体识别的肝靶向配体修饰脂质体。根据肝靶向给药系统理论,本研究的目的是:第一、采用酶催化技术,通过脂肪酶在有机相的介质催化合成甘露糖-月桂二酸酯-胆固醇（mannose-diester lauric diacid-cholesterol,Man-DLD-Chol）,寻找一种高效、低耗能和高区域选择性的合成方法,Man-DLD-Chol具有脂质体膜材的亲水亲脂性质,旨在合成的靶向配体与脂质体具有高结合率。第二、利用脂质体作为药物传送的载体,GA可包载于脂质体的磷脂双分子层内,Man-DLD-Chol接载于脂质体表面,旨在通过脂质体作为载体和Man-DLD-Chol作为肝靶向配体,提高GA的生物利用度及肝靶向性。第三、制备具有主动靶向性的GA脂质体（Man-DLD-Chol-GA-Lp）,旨在通过肝细胞膜的甘露糖受体特异识别Man-DLD-Chol,以受体介导的内吞方式,实现GA特异靶向于肝脏病变细胞,降低对正常非靶向组织及细胞的毒副作用,增强GA治疗肝炎及肝癌等肝疾病效果,为GA作为中药单体的开发及其在肝炎、肝癌的临床应用提供思路。方法:1.Man-DLD-Chol靶向配体的酶促合成研究。利用脂肪酶催化合成Man-DLD-Chol靶向配体,通过质谱仪（MS）及核磁共振仪（NMR）鉴定合成目标产物的结构;建立相对简单有效的分离纯化及含量测定的方法;考察影响合成的反应条件,并采用中心组合设计的效应面法优化合成工艺的参数。2.Man-DLD-Chol-GA-Lp的制备研究。建立HPLC方法学,用于测定脂质体中GA含量,比较三种脂质体制备方法对包封率的影响;以包封率和粒径为指标,考察处方工艺、制备工艺和冻干工艺的单因素,确定脂质体最佳的制备参数。3.Man-DLD-Chol-GA-Lp的质量控制研究。对Man-DLD-Chol-GA-Lp质量的各项理化性质进行详细的研究:采用扫描电镜观察脂质体的形态;利用纳米粒度仪测定脂质体的粒径、多分散系数（PDI）和Zeta电位;通过葡聚糖凝胶G-50分离游离GA与包载GA脂质体,HPLC测定载药脂质体的包封率、载药量和渗漏率;选取硫巴比妥酸反应法测定包载GA脂质体的氧化产物值;采用透析法测定各GA制剂的体外释放度;考察Man-DLD-Chol-GA-Lp在影响因素试验、加速试验和长期稳定性试验的稳定性。4.Man-DLD-Chol-GA-Lp的初步安全性研究。选取HepG2细胞作为模型细胞,以细胞存活率为指标,考察Man-DLD-Chol脂质体（Man-DLD-Chol-Lp）和空白脂质体对HepG2细胞的毒性情况;参考中国药典收载方法对各组GA制剂进行家兔热原检查和溶血试验;通过小鼠的单次给药方式,计算各组GA制剂的半数致死量(LD₅₀),评价GA-Lp和Man-DLD-Chol-GA-Lp在小鼠体内的急性毒性。5.Man-DLD-Chol-GA-Lp的体外靶向性研究。选取香豆素-6（Cou6）作为荧光探针,采用薄膜分散法制备Cou6脂质体（Cou6-Lp）和Man-DLD-Chol修饰Cou6-Lp（Man-DLD-Chol-Cou6-Lp）,并测定脂质体的理化性质;以HepG2细胞作为细胞模型,通过定性和定量分析考察HepG2细胞对各组GA制剂的摄取效率;利用MTT方法考察各组GA制剂对HepG2细胞增殖的抑制作用;通过Annexin V-FITC/PI双染法及流式细胞仪测定各组GA制剂促进HepG2细胞凋亡的作用。6.LC-MS/MS测定生物样品中GA含量的方法学研究。建立LC-MS/MS检测的方法学用于测定血浆和组织样品中GA含量,考察专属性、线性、精密度、提取回收率、稳定性等指标。7.Man-DLD-Chol-GA-Lp的血药浓度和组织分布研究。通过新西兰兔的耳缘静脉和昆明小鼠尾静脉分别注射Man-DLD-Chol-GA-Lp、GA-Lp及GA-S（剂量5.25mg/mL）,利用LC-MS/MS检测方法测定GA在新西兰兔的血浆和小鼠的组织（心、肝、脾、肺、肾）及血浆中的含量。比较药动学参数的差异,研究各组GA制剂在新西兰兔的药物动力学特征。同时,通过比较相对摄取率（Re）、靶向效率（Te）、相对靶向效率(R_Te)及峰浓度比（Ce）四个靶向参数,探究各组GA制剂在小鼠体内各组织的分布差异。成果:1.通过TLC、HPLC、MS和NMR确认了月桂二酸二乙烯酯、月桂二酸乙烯酯-胆固醇和Man-DLD-Chol的化学结构与性质;分别确定了硅胶柱层析、重结晶和C₁₈柱层析的分离纯化方法;建立中心组合设计效应面优化得最佳反应条件:月桂二酸乙烯酯-胆固醇0.536 mmol,甘露糖0.100 mmol,4?分子筛60 mg,生物酶N435 61.2mg,脱水的四氢呋喃2.5 mL和吡啶1.5 mL,恒温气浴摇床温度56.6℃,振荡27 h。2.采用薄膜分散法制备GA脂质体,以包封率和粒径为考察指标,确定了脂质体的处方工艺、制备工艺和冻干工艺。具体工艺参数如下:胆固醇/卵磷脂质量比为1:4,药脂比为1:12,Man-DLD-Chol配体比例为8%,缓冲液pH值为7.4,水化温度为50℃,超声功率和时间分别为250 W和20 min,冻干保护剂葡萄糖:甘露醇质量比为1:1,保护剂量为卵磷脂质量的10倍,加入方法为外加法,预冻温度为-60℃。3.GA-Lp和Man-DLD-Chol-GA-Lp的理化性质进行系统测定,结果如下:扫描电镜观察脂质体呈类球形,粒径分别为108.60±0.28 nm和120.80±1.34 nm,多分散指数（PDI）分别为0.107±0.008和0.095±0.004,Zeta电位分别为-26.15±0.64 mV和-33.15±1.34 mV,包封率为88.38±1.35%和85.90±0.73%,载药量分别为6.56±0.10%和6.38±0.05%,渗漏率在10天内小于0.1%,氧化产物值分别为0.106±0.011和0.069±0.004,溶血磷脂分别为1.27%和1.16%。体外释放度试验结果表明Man-DLD-Chol-GA-Lp具有缓慢释放药物的特征,释放药物规律符合Higuchi释放模型。Man-DLD-Chol-GA-Lp进行稳定性考察,影响因素试验结果提示脂质体需要低温避光密封保存,加速试验发现脂质体放置6个月粒径和渗漏率会明显增大,长期试验发现脂质体放置12个月后,脂质体的质量开始出现异常。4.细胞毒性结果显示,Man-DLD-Chol-Lp在浓度0.5-50μg/mL范围时,HepG2细胞存活率大于90%,表明脂质体的毒性作用小。热原检查试验的结果是GA脂质体制剂均不会诱导新西兰兔的热原反应。溶血试验的结果发现GA-S会导致溶血现象发生,GA-Lp和Man-DLD-Chol-GA-Lp均不会发生溶血现象。单次给药毒性试验的结果显示GA-Lp和Man-DLD-Chol-GA-Lp的LD₅₀值是90.165 mg/kg和87.717 mg/kg,分别是GA-S的1.60和1.56倍。5.Cou6-Lp和Man-DLD-Chol-Cou6-Lp的制备及其理化性质良好,粒径在120-180nm,Zeta电位稳定,包封率大于85%。细胞摄取试验结果显示Man-DLD-Chol-Cou6-Lp的荧光值最大,其摄取1 h和4 h的荧光强度分别是Cou6-Lp的1.60倍和1.45倍。细胞增殖抑制试验的结果可知,GA-S的IC₅₀值比较,GA-Lp和Man-DLD-Chol-GA-Lp对HepG2细胞的增殖抑制作用分别提高1.29-1.50倍和1.82-1.92倍。诱导细胞凋亡试验的结果发现,GA-S诱导12.98%HepG2细胞凋亡,GA-Lp可诱导19.78%HepG2细胞凋亡,同时Man-DLD-Chol-GA-Lp诱导HepG2细胞凋亡可达27.37%。6.方法学考察结果显示,血浆和组织匀浆液的杂质均不干扰GA与熊果酸的含量测定,专属性良好;GA在兔血浆、小鼠血浆和组织样品中的浓度范围内（5-5000 ng/mL）,相关系数r²均大于0.9989,线性结果良好;血浆及组织样品的日内精密度及日间精密度的最大RSD值分别为10.51%和11.19%,均小于15%;GA的提取回收率均在85-110%范围内,其RSD均小于15%;GA在室温、反复冻融以及预处理后低温（4℃）、冷冻（-20℃）保存条件下,真实浓度与测得浓度的相对偏差RE<15%。7.家兔血药浓度-时间试验的结果,与GA-S比较,GA-Lp和Man-DLD-Chol-GA-Lp的半衰期(t_1/2)短,t_1/2分别为2.51±0.44 h和1.78±0.08 h;同时Man-DLD-Chol-GA-Lp的清除率（CL,5.81±0.30 L/（h·kg））高于GA-Lp（5.00±0.30 L/（h·kg））和GA-S的清除率（3.36±0.11 L/（h·kg））;而且Man-DLD-Chol-GA-Lp的平均滞留时间(MRT_0-∞)最短（1.35±0.05 h）;此外,GA-Lp的表观分布容积（Vd,18.15±3.42 L/kg）和Man-DLD-Chol-GA-Lp的表观分布容积（14.90±0.55 L/kg）大于GA-S（12.83±0.88 L/kg）,GA-Lp的生物利用度（AUC）是Man-DLD-Chol-GA-Lp的1.16倍。小鼠的组织分布试验的靶向参数结果显示,GA-S对血浆和肾脏具有较大的选择性,Te分别为30.27%和29.14%,Man-DLD-Chol-GA-Lp对肝脏靶向的选择性显著性提高,其Te高达54.67%;与GA-S比较,Man-DLD-Chol-GA-Lp的R_Te对肝脏靶向性提高了3.39倍;此外,GA-Lp和Man-DLD-Chol-GA-Lp在肝脏、脾脏和肺的Re值均大于1,而且Man-DLD-Chol-GA-Lp在肝脏的Re值（4.78）和Ce值（3.46）最大。结论:综上所述,本研究通过脂肪酶催化成功合成脂质体的靶向配体Man-DLD-Chol,以脂质体作为载体,在脂质体表面接载Man-DLD-Chol,顺利将GA制备成具有肝靶向性的脂质体Man-DLD-Chol-GA-Lp。制备冻干的Man-DLD-Chol-GA-Lp的理化性质和初步安全性良好。通过HepG2细胞的体外靶向性研究表明,Man-DLD-Chol可提高GA在HepG2的摄取量,证实了Man-DLD-Chol-GA-Lp具有一定的肝靶向性,同时,对HepG2细胞增殖有较强的抑制作用和促进HepG2细胞的凋亡。在兔的血药浓度及在小鼠的组织分布试验中,肝脏靶向参数均提示Man-DLD-Chol-GA-Lp具有肝靶向性。基于上述试验的结果验证设想,有理由相信,Man-DLD-Chol-GA-Lp有潜能实现肝靶向治疗的药物传递系统。