研究背景近年来，随着器官移植和血液恶性肿瘤病人数量的不断增多，免疫抑制剂的广泛应用，重症免疫低下患者数目呈几何爆发趋势。机会致病菌曲霉菌所致的感染发病不断上升，已成为仅次于念珠菌感染的第二大深部真菌病。曲霉感染的病死率可达40％以上，晚期衰竭病人合并曲霉菌感染的病死率高达80％～100％，患者存活主要依赖于早期明确诊断和及时恰当的抗真菌治疗。而传统的实验室诊断包括真菌的培养、影像学诊断，不仅耗时较长，而且缺乏敏感性，所以探索一种检测曲霉菌快速可靠的方法已经成为临床实验研究的热点问题。研究目的在广泛复习国内外相关研究文献的基础上，通过自行设计引物、探针，建立简捷、经济的提取曲霉菌DNA的方法。以期提供适合国内临床需要的快速诊断曲霉菌感染的Real-time PCR标准化方案，为临床诊断提供参考。对收集的临床高度疑似曲霉菌感染病人的血标本进行单盲检测，评价其临床诊断效能。把实时荧光定量PCR与临床常用血清学方法检测结果进行比较，得出结论。同时探讨抗真菌药物对检测结果的影响，找出最适合的检测时机，提高检测阳性率，指导临床抽血检验。研究方法①荧光定量PCR检测方法的建立：在NCBI中的Genebank中查找相关菌属及人类的18S rRNA、5.8S rRNA、28S rRNA以及ITSⅠ、ITSⅡ基因序列。通过BLAST比对找出各菌属间特异、曲霉菌属内保守的基因区间。通过ABI Primer Express 2.0软件设计引物、探针。建立阳性克隆质粒：在选定的荧光探针靶基因的上下游设计引物，扩增片断长度在200～300bp。用普通PCR在烟曲霉标准菌珠基因组中进行特异性扩增，纯化产物，将此产物连接到pMD19-T vector中，得到重组克隆质粒，送往测序。证实后用于制作实时荧光定量PCR的标准定量曲线及阳性对照。取标准曲霉菌菌株制成悬浊液，摸索最佳的曲霉菌DNA提取方法，并进行重复性试验、最低检测下限及方法特异性的实验评价。②实时荧光定量PCR方法诊断效能的临床评价：收集2006年4月至2007年2月，广州南方医院高度疑似曲霉菌感染病例71例，标本232份。分成5批检测，每批随机抽得标本，编号，用荧光定量PCR单盲检测，后与临床病人信息核对，评价该方法的敏感度、特异度、准确度、阳性预测值及阴性预测值。同时用x~2检验(McNemar检验)与临床常用血清学方法—曲霉菌抗原(ELISA)检测进行对比。通过分析抗真菌药物使用前后患者检测结果的改变，找出抗真菌药物对荧光定量PCR检测结果影响的规律，以及其检测结果对病人预后的提示作用。研究结果①荧光定量PCR检测方法的建立：成功建立荧光定量PCR检测侵袭性曲霉菌感染的方法。针对曲霉菌rDNA基因的转录间隔区ITSⅠ设计引物、探针。扩增片段长79bp。对构建好的克隆质粒测序，插入片段与预期片段序列一致，相似性达99％。阳性克隆倍比稀释制作荧光定量PCR的定量标准曲线：Y=-0.37X+16.05，R~2=0.997。荧光定量PCR的重复性好，平均试验内变异系数分别为1.89％、1.56％、2.57％。平均试验间变异系数为3.32％、3.58％、4.50％。该方法最低检测下限达5～10CFU／ml，对白色念珠菌、隐球菌、毛霉菌、根霉菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的检测结果均为阴性，无非特异性扩增。②实时荧光定量PCR方法诊断效能的临床评价：71个病例中确诊10例，临床诊断30例，拟诊8例，非曲霉菌感染病例23例。232份标本中荧光定量PCR检测阳性率为42.2％(98／232)。该方法的敏感度为80％～87.5％，特异度为95.6％(22／23)，准确度为90.1％～90.7％。阳性预测值为88.8％～97.6％，阴性预测值为75.8％～91.7％；与曲霉菌抗原检测比较，两者的敏感度无统计学差别(P=0.549(双侧)，P＞0.05)：两者特异度比较中，P=0.021(双侧)，P＜0.05，特异度差异有显著性意义，荧光定量PCR的特异度较高。③抗真菌治疗对荧光定量PCR方法的影响及意义：临床上抗真菌治疗对荧光定量PCR检测结果有较大影响。临床经验性抗真菌药物的使用可使荧光定量PCR结果呈现假阴性。研究发现，侵袭性曲霉菌感染病人经药物治疗后，约60％～70％病人血标本荧光定量PCR检测结果转为阴性。为提高检出率，早日明确诊断，故建议在病人未使用药物治疗之前抽血送检。此外，一些曲霉菌感染的病人在停用抗真菌药物之后，有很大的复发可能，在治疗前后，连续动态监测病人血中曲霉菌DNA是必要的。荧光定量PCR结果持续阳性，往往提示病人预后很差，病死率较高(6／8)。研究结论①成功建立侵袭性曲霉菌感染荧光定量PCR检测新技术：自主设计的检测曲霉菌特异性的引物探针，达到了国外相关研究的水平，有较高的敏感度、特异度。同时，建立了适合临床实验室采用的简单、快速、经济的提取曲霉菌DNA的方法。构建了含有目的扩增片断的阳性质粒做为阳性对照，为产品形成试剂盒打下基础。②完成侵袭性曲霉菌感染荧光定量PCR检测新技术的临床效能评价：检测临床高度疑似曲霉菌感染病人血清，有较高的准确度及阳性预测值。该方法对重症免疫低下患者曲霉菌感染的早期诊断有很大的提示作用。与血清学方法相比，荧光定量PCR检测结果具有更客观可靠、易于判断等优点。该项技术有待进一步标准化，为今后国内同类研究提供一定的参考依据。它的较广阔的临床应用前景，有望早日投入市场，为广大患者服务。课题的创新之处(1)通过特异性引物、探针的设计，建立具有自主知识产权的曲霉菌荧光定量PCR检测新技术。(2)建立适合临床实验室采用的提取曲霉菌DNA方法。(3)曲霉菌荧光定量PCR技术可同时检测包括烟曲霉菌在内的5种常见曲霉菌(黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、构巢曲霉)，覆盖面全。(4)比较荧光定量PCR方法与血清学方法对临床病例标本诊断效能的差异，对荧光定量PCR方法进行了较全面的诊断效能评价。