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目的:胶质母细胞瘤(GBM)是最常见的原发性恶性脑肿瘤,具有高度侵袭性、致命性、易复发的特点。其治疗方案包括手术切除、局部或全身化疗、放射治疗、抗血管生成靶向药物及交替电场等多种治疗措施。尽管如此,GBM患者的预后仍然不佳,5年生存率不到10%。当务之急是开发一种新的安全有效的替代治疗方案,以期延长患者生存、改善生活质量。大量研究证明,利用宿主免疫系统来引导免疫应答的免疫治疗是未来GBM治疗的方向。目前,应用基因转移技术在自身T细胞上引入抗肿瘤的嵌合抗原受体(CAR),赋予T细胞靶向特异性识别和杀伤功能的过继性CAR-T细胞治疗,已在GBM临床试验中取得了较好的疗效,为改善患者预后提供了希望。但现阶段,递送目的CAR基因在T细胞中表达的病毒载体面临着插入突变、遗传毒性、免疫源性强、制造成本高昂等问题,一定程度上影响了实际应用。一种被称为微环DNA的非病毒载体越来越受到人们的关注,这是一种新颖的小环超螺旋表达框,因其无插入突变风险,无免疫源性,制造成本低,缺乏抗性标记基因和复制原点等细菌序列,以及体内更持久和更高的基因表达等特征,成为理想的基因运载工具。有临床前研究和临床试验研究表明,以IL-13Rα2为靶点治疗GBM显示出良好的应用前景。本实验研究拟采用电穿孔技术实现微环DNA的有效转染,制备IL-13Rα2靶向的CAR-T效应细胞,通过检测CAR-T细胞的杀伤效率及细胞因子IFN-γ、IL-2的分泌功能,验证非病毒转染制备CAR-T的可行性。方法:(在CNKI、PMC、PubMed数据库上查阅过继CAR-T细胞治疗肿瘤的原理及微环DNA载体的相关研究,熟知IL-13配体与IL-13Rα1、IL-13Rα2受体结合的生理学作用,了解IL-13Rα2在GBM中的表达情况及其促进GBM发生、发展的机制。(2)从本实验室保存的亲本微环DNA质粒中提取含有IL-13CAR目的基因片段的微环DNA载体质粒,CAR的基本结构为IL-13-CD28-4-1BB-CD3ζ。(3)采用电穿孔方法将微环DNA载体质粒转染到T细胞中,观察T细胞的存活情况、T细胞分子表型CD3/4/8是否发生改变以及转染效率,分别用流式细胞术及Western blot检测T细胞表面IL-13CAR的表达情况。(4)流式细胞术检测U251及A549细胞的IL-13Rα1及IL-13Rα2表达量,体外条件下,将IL-13CAR-T细胞与U251胶质瘤细胞、A549肺癌细胞共培养,验证在不同的效靶比下IL-13CAR-T的体外杀伤效果,同时ELISA检测IL-13CAR-T的IFN-γ及IL-2分泌量。结果:1.成功诱导、提取出含有目的片段IL-13CAR的微环DNA载体质粒。2.成功实现IL-13CAR微环DNA载体质粒的电转染,电转后T细胞的存活率在58%左右,T细胞表面IL-13CAR的表达效率最高为38.8%,Western blot可见清晰的IL-13CAR蛋白表达。3.应用电穿孔转染微环DNA到T细胞的方法未对T细胞的分子表型如CD3、CD4、CD8造成影响。4.IL-13CAR-T细胞对高表达IL-13Rα2,相对低表达IL-13Rα1的U251细胞杀伤效率高,对不表达IL-13Rα2,仅表达IL-13Rα1的A549细胞未见明显杀伤。5.高表达IL-13Rα2的U251细胞能够刺激IL-13CAR-T细胞分泌大量IFN-γ及IL-2;不表达IL-13Rα2的A549细胞未见明显刺激IL-13CAR-T细胞分泌IFN-γ及IL-2。结论:1.成功制备含有IL-13CAR目的基因的微环DNA载体质粒。2.电穿孔转染T细胞后获得相对高表达IL-13CAR的IL-13CAR-T效应细胞。3.IL-13CAR-T效应细胞能特异性杀伤IL-13Rα2高表达的肿瘤细胞,并具有分泌大量IFN-γ及IL-2细胞因子的功能。