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Hirulog-S((D)FPRP-GK(Stearic)GG-QGDFEPIPEDAYDE)是本课题组根据比伐卢定缺点和水蛭素Ⅲ型优点而设计的高效新型抗凝血多肽,其中含有一个疏水性的硬脂酸侧链。它与临床药物比伐卢定(Hirulog-1)相比具有显著优点:(1)抗凝活性是比伐卢定的10倍以上,半衰期适中(8小时),高于比伐卢定18倍(半衰期为25分钟),且作用平缓,(2)一天一次或两次静脉注射可保持很高的抗凝活性,用量低于比伐卢定10倍以上,能克服比伐卢定用量大(250 mg/瓶)、半衰期短、连续静脉滴注的缺点。用于预防溶栓后再栓塞,或深静脉血栓形成等,特别适合于PCI手术及与溶栓药共用抗凝。因此,对Hirulog-S质量分析及冻干粉针剂的研究具有非常重要的意义,为其进一步临床应用奠定基础。本论文在已有工作基础上开展了如下研究:(1)利用手工固相方法,合成了四批Hirulog-S多肽;(2)本论文参考中国药典、相关文献及书籍,建立了适合Hirulog-S原料药的质量分析方法,其质量研究工作包括理化常数测定、鉴别、纯度检验、含量测定及稳定性研究等,并建立起质量标准草案;(3)研究了Hirulog-S冻干粉针剂的配方并对其进行了质量研究和稳定性试验等。本论文取得的主要结果有:1.合成硬脂酸修饰的Fmoc-赖氨酸约54.3 g,为Hirulog-S多肽的规模合成提供了氨基酸原料。2.使用手工固相法合成Hirulog-S多肽(理论分子量2685.37 Da),采用Rink-树脂(取代率0.73 mmol/g)作为固相载体,原料为Fmoc保护的天然氨基酸,20%哌啶作为脱保护剂,HOBT/HBTU/DIEA作缩合剂,缩合完成后进行裂解得到目标产物。共合成四批,每批规模分别为5、10、10、20 mmol,粗产量分别为9.36、15.40、22.60和42.92 g,粗产率的平均值为73%。经高效液相纯化,目前已得到13.8 g。3.原料药的质量分析(1)通过对Hirulog-S多肽的氨基酸组成分析,序列测定及质谱鉴定表明它的一级结构与理论计算相符,比旋度结果表明此肽为左旋性药物。(2)通过不同色谱柱的等度洗脱和梯度探索,获得Hirulog-S分析的较理想的洗脱梯度(HPLC)。在25.4~508μg/mL范围内,以峰面积(Y)为纵坐标,样品浓度(X)为横坐标,进行线性回归,方程为:Y = 19.289 X - 175.08,R2 = 0.9990,峰面积与浓度线性关系良好。测定Hirulog-S样品中的含量及有关物质,结果三批样品(批号20100301,20100302,20100303)含量分别是99.7%±1.3%,100.4%±1.1%,99.4%±0.96%,总有关物质分别在0.59%~0.97%之间。(3)采用卡尔菲休库仑滴定法准确测定了三批样品及对照品(批号:20100304)中的水分含量。所得的结果分别为2.3%±0.05%,2.1%±0.06%,2.1%±0.11%,2.3%±0.12%,批次之间水分含量均匀。(4)采用RP-HPLC方法,进行本品中TFA含量的测定,结果分别为12.08%±0.15%,9.08%±0.14%,12.76%±0.21%,10.93%±0.08%。(5)使用硫代乙酰胺法和古蔡氏法测定重金属(Ag、Pb和As)含量均小于10 ppm,符合药物申报要求。(6)用色谱法进行了Hirulog-S稳定性试验,结果表明Hirulog-S在一定的环境下是稳定的。4.冻干粉针剂的配方研究及质量分析(1)通过筛选获得了Hirulog-S的冻干粉针剂的配方为:每瓶25 mg多肽,12.5 mg甘露醇,用0.5 M的碳酸钠调节pH为8左右,冻干得白色粉末。(2)对Hirulog-S冻干粉进行了质量分析以及稳定性研究。5.在质量研究的基础上,制订了Hirulog-S原料药质量标准草案,经检验,该标准能有效地控制产品的质量。