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采用基因工程手段构建重组菌可以对产甘油假丝酵母代谢途径进行有目的的改造,进一步改进产甘油假丝酵母的性能,以达到提高甘油产量和改善工艺的目的。实现这一目标首先要获得有效的载体和转化方法,而构建酵母整合型载体的一项重要工作是获得遗传标记和整合位点。 通过功能互补的方法从产甘油假丝酵母基因组文库中筛选出产甘油假丝酵母的乳清苷酸脱羧酶基因(URA3)和磷酸核糖氨基苯甲酸异构酶基因(TRP1)。测序后通过序列相似性搜索及结构基因搜寻,物理定位了产甘油假丝酵母的URA3基因和TRP1基因。产甘油假丝酵母的URA3基因编码区786 bp,推测的氨基酸序列与酿酒酵母URA3基因编码区推测的氨基酸序列相似性为76.60%。产甘油假丝酵母的TRP1基因编码区669 bp,推测的氨基酸序列与酿酒酵母TRP1基因编码区推测的氨基酸序列相似性为35%。克隆的产甘油假丝酵母的URA3基因可以完全互补酿酒酵母Ura3~-突变株,克隆的产甘油假丝酵母的TRP1基因可以完全互补酿酒酵母Trp1~-突变株。 通过氨基酸序列保守区设计简并引物,扩增出了产甘油假丝酵母核糖体蛋白L41基因部分核苷酸序列,并利用基因组文库获得了L41基因完全的结构基因及内含子序列。分析产甘油假丝酵母核糖体蛋白L41基因的核苷酸序列,蛋白质编码序列318 bp,编码区起始密码子开始第四个碱基处插入内含子序列386 bp。产甘油假丝酵母L41蛋白基因编码106个氨基酸组成的蛋白,与其他酵母核糖体蛋白L41氨基酸序列保守性极强,相似性从82.1%(麦芽糖假丝酵母(Q))到91.5%(产朊假丝酵母)。定点突变了产甘油假丝酵母核糖体蛋白L41基因,使其第56个氨基酸由脯氨酸突变为谷氨酰胺,以此为基础可以构建产甘油假丝酵母抗性转化系统。 PCR扩增了产甘油假丝酵母部分长度的18S rDNA序列和26S rDNA D1/D2区序列,除了做为同源整合的靶顺序构建高拷贝整合载体外,还进行了以18S rDNA和26S rDNA D1/D2区碱基序列比对为依据的分子分类学研究,研究发现产甘油假丝酵母与克鲁斯假丝酵母有很高的同源性。