对虾白斑综合症病毒LAMP-LFD检测方法的建立

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本研究建立了WSSV的环介导等温扩增的快速检测方法(Loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)的检测方法,并将该法与研制的FITC核酸检测侧向层析试纸(FITC nucleic acid detection lateral flow dipstick,FITC-LFD)相结合建立了更为灵敏、特异、有效、更适合实地检测的WSSV检测方法LAMP-LFD。   参照GenBank上发表的WSSV基因组序列中的保守的囊膜蛋白基因VP28基因序列,设计两条特异性的引物对其进行PCR扩增,并将产物与pDM-19T连接构建重组载体pDMT-VP28;依照LAMP技术原理,利用Primer Explorer V4设计了四条引物利用构建的VP28重组载体为标准模板,优化建立了WSSV的LAMP检测方法;而后对WSSV-DNA为模板进行十倍系列稀释,并以其为模板对LAMP与nested-PCR进行了检测限的比较。结果显示,WSSV-LAMP最佳反应温度为65℃、反应时间为60min;LAMP对WSSV-DNA的最低检测限为10拷贝、μL,而nested-PCR为100拷贝/μL,敏感性显著显著高于nested-PCR。   利用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)与蛋白质亲和的作用,将其与BSA、OVA偶联;以FITC-BSA免疫BALB/c小鼠,间接ELISA测定多抗血清效价,并对血清敏感性和特异性进行鉴定以确定细胞融合备用鼠。结果显示:1号小鼠pAb效价最高,对FITC的半数抑制浓度最低,选择用1号鼠进行融合。利用杂交瘤细胞技术制备FITC单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb),经筛选得到6株高度敏感特异的杂交瘤细胞;以1B11体内诱生腹水制备单克隆抗体,制备腹水效价为1/640000,半数抑制浓度IC50为7.812ng/mL,获得了效价高、特异性强的FITC-mAb。   柠檬酸三钠还原法制备胶体金并将其按3μL/条的量喷至玻璃纤维塑薄膜上;以0.5mg/mL的亲和素和1 mg/mL的山羊抗鼠IgG按照1.2μL/cm得量分别标记NC膜上的检测线(T线)和控制线(C线);组装FITC核酸检测侧向层析试纸(FITC-LFD)。利用带有生物素的引物FIP进行LAMP扩增,在反应完成前加入FITC的探针进行杂交5min,终止反应后以试纸检测,建立WSSV-LAMP-LFD检测方法;根据该试纸检测不同条件下的扩增产物得到的结果,优化得到最适检测用LAMP扩增条件;而后对WSSV-DNA为模板进行十倍系列稀释,并以其为模板进行WSSV-LAMP-LFD检测。结果显示:FITC-LFD的最适检测用LAMP扩增条件为64℃,50min;该方法对WSSV-DNA的最低检测限为10拷贝/μL,与LAMP检测方法灵敏度相同。  
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