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DNA聚合酶最初是在活生物体中DNA复制的基础分子生物学研究中被发现。众所周知，DNA聚合酶通过使用脱氧核苷三磷酸在DNA的复制过程中根据模板DNA合成新的DNA链。DNA聚合酶催化引物的3’-羟基末端和进入的三磷酸的磷酸基之间形成磷酸二酯键。目前，许多耐热DNA聚合酶被用于PCR以及参与核酸复制的其他程序，包括多重PCR，巢式PCR，反转录PCR和DNA测序。聚合酶也可用于掺入经过修饰了的核苷酸，包括那些标签、报告或向DNA产物发信号的核苷酸。这些允许从复杂的样品，包括血液，唾液，法医痕迹，和化石遗体中扩增核酸。特定聚合酶的选择取决于具体的需要，特别是对持续合成能力和保真度、起始的温度或接受非天然核苷酸类似物的能力。每个原始的和基因改造产生的聚合酶具有不同的特点。然而，适当聚合酶的合理选择取决于应用程序本身。本实验第一部分采用重叠延伸PCR方法介导的定点突变技术对高保真DNA聚合酶进行基因工程改造，并在大肠杆菌中得到高效表达，以期DNA聚合酶掺入核苷酸修饰底物（如脱氧核苷酸、双脱氧核苷酸、核糖核苷酸和无环核苷酸）的能力增强。用Taq DNA聚合酶单克隆抗体实现热启动PCR，能够减少引物错配、降低引物二聚体的形成和非特异性扩增的产生，从而增加PCR的特异性。本实验第二部分以DNA聚合酶为靶分子，从羊驼天然噬菌体文库中采用生物亲和淘选的方法获取DNA聚合酶纳米抗体，并结合分子克隆技术，表达和纯化酶抗体，目的是应用于热启动PCR，主要研究内容及结果如下： 1.采用重叠延伸PCR介导的定点突变技术，对DNA聚合酶基因依次引入了六个突变，成功构建了四种重组质粒，分别是pET22b-polAD146AE148A、pET22b-polAD146AE148AA490L、pET22b-polAD146AE148A413LYP415SAV和pET22b-polAD146AE148A413 LYP415SAVA490L。 2.在E.coli BL21(DE3)、E.coli Rosetta(DE3)plysS和E.coli BL21 CodonPlus(DE3)RIL三种宿主菌中选取E.coli BL21(DE3)作为表达菌，优化后的诱导表达条件为0.1mM IPTG在37℃下诱导3h。并且优化了重组DNA聚合酶PCR反应缓冲液组分：pH9.0、5mM(NH4)2SO4和1.5mM Mg2+。同时，重组DNA聚合酶具有很强的耐热性，95℃处理6h后仍有酶活。用Bradford法测定蛋白浓度，经梯度滴定法测得自制酶酶活为7.5U/μL，比活力为18293U/mg。 3.以Taq DNA聚合酶为靶蛋白，采用固相淘选的方法，获得五个特异性结合的纳米抗体；以自制DNA聚合酶为靶蛋白，采用固相淘选的方法，获得五个特异性结合的纳米抗体。 4.采用分子克隆技术，成功构建了pET25-T6、pET25-T19和pET25-S3三个原核表达载体，转化到E.coli Rosetta(DE3) plysS宿主菌中，经0.2mM IPTG诱导表达后，得到了可溶性的纳米抗体蛋白T6、T19、S3。ELISA鉴定表明，仅S3蛋白与自制酶有高亲和力，但不是结合在酶活性中心，因此不能应用于热启动PCR。