甲型副伤寒沙门菌(Salmonellaentericaserovar Paratyphi A,S.Paratyphi A)是引起甲型副伤寒(Paratyphoid fever)的病原菌。在过去几十年,尤其在二十世纪九十年代中期开始,甲型副伤寒的暴发在许多国家报道增多,尤其是东南亚的一些国家,甚至超过伤寒沙门菌的感染,已成为新的公共卫生问题。脉冲场凝胶电泳(Pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)由于其重复性好、分辨率高,已经用于多种致病细菌的分子分型、流行病学调查和微生物学研究。然而,我们发现目前基于PulseNet国际网络实验室用于分析沙门菌的PFGE的一天标准化方案对我国分离自不同的年份和省份的甲型副伤寒沙门菌进行分析,仅仅获得有限的带型。那么这种标准化PFGE方案在分析甲型副伤寒沙门菌时,是分型方法不适宜该菌基因组分析而导致区分能力有限还是这些跨越如此多年和省份的流行菌株就是保守性克隆,还需要进行分析。为探索可能更适合于甲型副伤寒沙门菌分离株的PFGE分析程序,本研究中我们基于PulseNet国际网络实验室用于分析沙门菌的PFGE 一天标准化方案,选择分离自我国不同年份和省份的33株甲型副伤寒沙门菌,通过比较不同核酸内切酶和电泳参数,对PFGE方案进行比较优化以用于分型甲型副伤寒沙门菌。然后用新的优化方案,对分离自不同年代(1998-2010)和12个省份的菌株进行回顾性分析。结果显示SpeI,XbaI,XhoI and BlnI四种酶都适合于分析甲型副伤寒沙门菌,通过对33株菌的相似度和分辨率的分类和比较分析,发现SpeI-PFGE比XbaI-PFGE和XhoI-PFGE产生更多的带型和更高分辨率,所以SpeI被考虑是首选酶,XbaI-PFGE的分辨率比XhoI-PFGE稍低,但是XbaI-PFGE所获得的带型数目比XhoI-PFGE多,因此我们认为XbaI作为次选酶,而XhoI作为第三种酶。BlnI-PFGE与上面三种酶相比,产生最少的带型和最低的分辨率,没有在进一步的研究中采用。此外,在对每种酶使用的三种参数进行比较分析,发现使用XbaI酶切的PFGE电泳参数(1.5-29s,20h)、使用SpeI的电泳参数(1-20s,20h)、使用XhoI的电泳参数(2.2-29s,20h)分辨率在各酶中最高,分别为17种、23种和16种。用新的电泳参数对106株甲型副伤寒沙门菌的分析结果显示中国的甲型副伤寒流行中存在高度克隆化的菌株引起全国范围的扩散,但随着年份变迁和流行地区扩大,也积累了散在的变异。多位点可变数目串联重复序列分析(Multiple Locus Variable Numbers Tandem Repeat Analysis,MLVA)是近年发展起来的以PCR技术为基础的分子分型方法。已进行的评价发现该方法分辨率高、重复性好、操作过程不复杂,已经用于多种致病菌包括沙门菌多种血清型的流行病学分析。本研究中我们探索建立用于分析甲型副伤寒沙门菌的MLVA方法并对其在流行病学中的应用价值进行评价。应用TRF和TRD软件扫描甲型副伤寒沙门菌测序株ATCC9150的全基因组,共获得196个串联重复位点(Tandem Repeat,TR),对获得的TR设计引物,选择33株在分离时间与地点尽可能分散、PFGE带型上有差异的甲型副伤寒沙门菌菌株作为评价样本(panel),从所有TR中筛选具有多态性的位点,利用这些位点建立可用于甲型副伤寒沙门菌的MLVA实验方法。再对我国12个地区1998年-2010年分离的209株甲型副伤寒菌株进行MLVA和PFGE分析,将这两种分型方法的实验结果进行比较分析,评价MLVA用于甲型副伤寒沙门菌分型的价值。在33株分离株的检测中,仅发现7个VNTR位点拷贝数变化。基于这7个VNTRs位点,对209株甲型副伤寒沙门菌分离株进行MLVA分析,与PFGE(本研究优化的SpeI酶切和电泳参数)实验结果比较,发现其分型能力明显弱于PFGE,MLVA区分出了 21种型别而PFGE区分出了 65种型别。也提示在甲型副伤寒沙门菌中,尤其在一个区域流行扩散中,基因组VNTR不容易发生拷贝数的变化。我们认为MLVA不适于对一个区域(国家或地区)流行的甲型副伤寒菌株的分子分型监测和流行病学调查,但在遗传进化分析中的克隆群确定上能够发挥作用。MLVA操作比PFGE简便,时间短,实验过程容易标准化,一些PFGE相同的甲型副伤寒沙门菌菌株可以用MLVA进一步分型,与PFGE联合应用可以提供较PFGE更高的分辨力,因此可以作为一种辅助的分子分型方法,用于在甲型副伤寒的流行病学调查中需要对PFGE分型结果进行深入分析时的补充。