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猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)主要引起猪的病毒性腹泻,这两种病原引起的腹泻对2周龄内新生仔猪危害尤为严重,可导致感染仔猪发生严重的腹泻、呕吐与脱水,死亡率高达100%,给养猪业造成严重的经济损失。如何增强猪的肠道特异性黏膜免疫对其防治具有重要意义。本研究在临床分离鉴定PEDV的基础上,基于PEDV和TGEV相似的致病机理和免疫特点,创新性研究增强黏膜免疫诱导效力的新型口服基因疫苗的免疫机理,以PEDV S基因及TGEV S双基因为靶基因,pVAXD双启动子真核表达质粒为载体,进行减毒沙门氏菌携带的PEDV和TGEV二联DNA疫苗的构建与免疫原性研究,主要研究内容如下：1.猪流行性腹泻病毒的分离鉴定本文用Vero细胞成功地从仔猪腹泻粪样中分离了PEDV四川分离株(SC-L株),并对其生物学特性进行了初步研究。PEDV SC-L在Vero细胞上连续传代,增殖稳定,典型病变在接毒后48小时开始出现,表现为细胞变圆、细胞肿胀、最终细胞皱缩、破碎并脱落。通过透射电镜观察发现：病毒粒子在感染细胞胞浆内可见散在或呈晶格状排列的空心或实心的病毒粒子；病毒粒子成堆或成串排列在细胞膜上,与细胞膜融合,然后以胞外分泌的方式被释放到细胞膜外。病毒对5-溴脱氧尿核苷不敏感,是一种RNA病毒,对氯仿、乙醚敏感,60℃或以上处理30min便会失去感染力。通过对其S基因S1区进行序列测定,发现与韩国DR13株同源性最高,核苷酸同源性高达99.2%。遗传进化树分析显示所分离毒株与韩国DR13分离株亲缘关系最近。该毒株的成功分离为该病的诊断和防制积累了基础材料。2. PEDV S基因主要抗原区域基因片断的克隆及原核表达研究采用PCR方法从PEDV S基因TA克隆质粒中扩增出S基因的主要抗原区域基因片段Sa,扩增得到的Sa片段插入到pMD19-T simple中,构建的重组质粒命名为pMD19-T-Sa。对核苷酸序列进行测定和分析：扩增的基因长度为739bp,可编码247个氨基酸残基。本研究将Sa插入pET-32a(+)原核表达质粒,构建了原核表达质粒pET-32a(+)-PEDV-Sa,在大肠杆菌BL21中进行原核表达,SDS-PAGE电泳鉴定,原核表达质粒pET-32a(+)-PEDV-Sa表达的目的融合蛋白大小为45Kd,表达的蛋白经亲和层析法纯化后免疫家兔,制备PEDV Sa重组蛋白的多克隆抗血清。3. PEDV S基因与TGEV S基因双基因共表达真核质粒的构建采用RT-PCR扩增PEDV S基因S1区(包含病毒的主要中和表位和受体结合区域)和TGEV SC-H株S基因(包含A、B、C、D四个抗原位点),分别将其插入pMD19-T simple载体,构建重组质粒pMD19-T-PSl与pMD19-T-TS。对pMD19-T-PS1与pMD19-T-TS的核苷酸序列进行测定：克隆的PEDV SC-L株S1基因长约2367bp,编码789个氨基酸残基,TGEV SC-H株S基因长约1896bp,编码632个氨基酸残基。序列比对分析显示：PEDV SC-L株S1基因编码的氨基酸序列与其它PEDV毒株的同源性在88.8%-98.6%,TGEV SC-H株与其它TGEV毒株S基因编码的氨基酸序列同源性在95.5%～99.7%之间。研究以pVAXD双启动子真核表达质粒为载体,构建了能够同时表达PEDV S1和TGEV S基因的真核表达质粒pVAXD-PS1-TS以及分别单独表达PEDV S1基因和TGEV S基因的真核表达质粒pVAXD-PS1和pVAXD-TS。将构建成功的三种真核表达质粒以脂质体法分别转染COS-7细胞,通过间接免疫荧光检测发现：真核表达质粒转染的COS-7细胞在倒置荧光显微镜下呈现特异性荧光；表明上述构建的三种重组质粒可在体外表达。PEDV S1基因与TGEV S基因真核表达质粒pV AXD-PS1-TS、pV AXD-PS1与pVAXD-TS的成功构建为PEDV和TGEV DNA疫苗的进一步研究奠定了基础。4.携带PEDV S和TGEV S双基因的减毒沙门氏菌口服疫苗免疫研究研究将三种真核表达质粒pV AXD-PS1-TS、pV AXD-PS1与pVAXD-TS分别电转化入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207中,构建了同时携带PEDV S1和TGEV S基因的重组减毒沙门氏菌SL7207(pVAXD-PS1-TS);以及携带PEDV S1基因的重组减毒沙门氏菌SL7207(pVAXD-PS1)和携带TGEV S基因的重组减毒沙门氏菌SL7207(pVAXD-TS)。小鼠灌胃接种重组减毒沙门氏菌后,提取小鼠肠道细胞总RNA,通过RT-PCR检测S1与S基因的转录。将重组菌SL7207(pVAXD-PS1)与SL7207(pVAXD-TS)混合以1×109CFU/只的剂量灌胃接种小鼠,SL7207(pVAXD-PS1-TS)以1×109CFU/只的剂量灌胃接种,间接ELISA方法检测免疫后小鼠的特异性PEDV和TGEV血清IgG以及肠道IgA抗体水平。结果：重组减毒沙门氏菌可有效激发免疫小鼠特异性PEDV(?)TGEV血清IgG以及肠道IgA抗体的产生,具有良好的免疫原性。通过比较单基因混合免疫组和双基因免疫组之间的抗体水平进一步表明：单基因混合免疫组的特异性血清IgG与肠道IgA抗体在三个免疫组中最高,且在免疫后第六周显著高于(P<0.05)其它免疫组。研究为PEDV和TGEV口服DNA疫苗的研究和应用奠定了基础。