慢性粒细胞白血病(CML)是慢性白血病中最常见的一种类型，约占成人白血病的15％。在全球范围内，慢性粒细胞性白血病的发病率为1～2/10万，在中国约为0.36～1/10万，以中老年人为主。BCR-ABL1蛋白的小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)-伊马替尼(IM)的出现，彻底改变了CML的治疗方式，使CML患者每年的相关死亡率从10～20％降到了1～2％，10年生存期也由10～20％提高到80～90％。TKI药物的不断出现，为维持CML患者的长期缓解状态带来了美好的前景。　　IM使CML从一种致命的恶性疾病变成了一种慢性疾病。然而，约20～40％新诊断的CML慢性期患者，最终因为药物的不良反应或耐药需要更换治疗方式。耐药的主要原因可分为BCR-ABL1酪氨酸激酶依赖性耐药和非依赖性耐药，依赖性耐药主要与100多种酪氨酸激酶区突变相关。而在非依赖性耐药中，虽然TKI药物成功抑制了BCR-ABL1激酶的活性，但是旁路信号通路的激活，弥补了酪氨酸激酶活性的损失，可促使CML细胞持续增殖，凋亡下调，最终导致TKI耐药。然而，引起BCR-ABL1非依赖性耐药的相关机制尚未明确。　　鉴于上述原因，本研究针对CML患者的BCR-ABL1酪氨酸激酶非依赖性耐药，通过临床病例信息、骨髓/外周血样本检测和体外细胞模型构建等方式，利用高通量测序以及CRISPR/Cas9基因编辑等实验技术，初步探讨了BCR-ABL1非依赖性耐药相关的异常基因、信号通路及耐药机制。　　第一部分 慢性粒细胞白血病早期分子学反应与伊马替尼耐药的临床研究　　目的:　　探讨CML-CP患者早期分子学反应与IM耐药之间的关系。　　方法:　　1.采用Sanger法测序，检测IM耐药患者的BCR-ABL1激酶区突变情况，明确其耐药类型;　　2.分析早期分子学反应与IM治疗、耐药的关系;　　3.统计学处理:年龄和时间等变量采用中位数描述，不同组间分类资料的比较采用x2检验，两样本定量资料的比较采用方差齐性检验和独立样本t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义，采用SPSS20.0进行统计分析。　　结果:　　1.198例未检出激酶区突变的IM耐药患者，早期服用羟基脲、马利兰或干扰素作为初始治疗药物的比例较高(43％)，且非IM药物使用时间越长，后期出现无激酶区突变的耐药患者比例越高;　　2.初始使用非IM药物的时间越长，患者BCR-ABL13mon＞10％的风险越高，IM耐药时无激酶区突变的比例越高;　　3.当BCR-ABL13mon≤10％，BCR-ABL16mon＞1％的患者中，耐药发生时检出激酶区突变的比例较高。　　结论:　　1.CML患者IM治疗前，干扰素和羟基脲、马利兰等细胞毒药物的使用，可能会造成患者的BCR-ABL1酪氨酸激酶非依赖性耐药;　　2.BCR-ABL1酪氨酸激酶非依赖性耐药，可能会导致CML患者3个月时的分子学反应较差，但不影响IM出现耐药的时间;　　3.CML患者6个月时BCR-ABL1水平升高，提示可能出现BCR-ABL1激酶区突变导致的继发耐药。　　第二部分 高通量测序技术筛选慢性粒细胞白血病BCR-ABL1非依赖耐药相关基因　　目的:　　高通量测序技术筛选CML患者中BCR-ABL1酪氨酸激酶非依赖性耐药相关的异常基因。　　方法:　　1.采用高通量测序技术，以口腔粘膜为对照，筛选BCR-ABL1非依赖性耐药相关基因;　　2.采用Sanger法测序，验证347例CML耐药患者中相关基因突变频率;　　3.检测相关基因表达水平，进一步分析可能存在的耐药原因;　　4.统计学处理:数据用均数±标准差描述，不同组间分类资料的比较采用x2检验，两样本定量资料的比较采用方差齐性检验和独立样本t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义，采用SPSS20.0进行统计分析。　　结果:　　1.19例无BCR-ABL1激酶区突变的IM耐药患者，采用高通量测序技术筛查578个肿瘤相关基因，筛选结果提示，KMT2C K339N和RUNX1H214P可能与BCR-ABL1非依赖性耐药相关;　　2.无激酶区突变的198例CML IM耐药患者中，检出25例KMT2C K339N突变，其突变频率明显高于携带激酶区突变的耐药患者，而RUNX1H214P在二组间的突变频率较低，且无明显差异;　　3.KMT2C mRNA表达水平与IM耐药类型及KMT2C K339N突变无相关性。　　结论:　　1.KMT2C K339N不伴随KMT2C mRNA表达水平的改变，提示K339N点突变可能造成KMT2C蛋白功能学上的异常;　　2.KMT2C K339N可能激活相关旁路信号通路，导致CML患者BCR-ABL1酪氨酸激酶非依赖性耐药。　　第三部分 KMT2C调控H3K4单甲基化与慢性粒细胞白血病BCR-ABL1非依赖耐药的机制研究　　目的:　　进一步明确KMT2C K339N点突变与BCR-ABL1酪氨酸激酶非依赖性耐药的关系及机制。　　方法:　　1.采用Western Blot法，分析在CML中，KMT2C K339N与不同H3K4甲基化修饰间的关系;　　2.通过Real-time RT-PCR和Western Blot法，分析KMT2C K339N与PI3K/AKT信号通路间的关系;　　3.统计学处理:数据用均数±标准差描述，两样本定量资料的比较采用方差齐性检验和独立样本t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义，采用SPSS20.0进行统计分析。　　结果:　　1.H3K4甲基化水平分析，KMT2CK339N患者的H3K4me1水平明显低于KMT2CWT患者，而H3K4me2和H3K4me3在二者间均没有明显差异;　　2.KMT2CK339N患者中PTEN和P21的水平均明显下降，AKT Thr308、AKTSer473和XIAP的水平明显升高，而PI3K p110α、AKT、BCL-2、BAX和P27的表达水平均与KMT2CWT患者没有明显差异。　　结论:　　1.KMT2C K339N可能通过下调H3K4me1水平来激活旁路信号通路，引起BCR-ABL1酪氨酸激酶非依赖性耐药;　　2.H3K4me1下调可能通过抑制PTEN表达，进而磷酸化AKT，调节细胞周期抑制蛋白P21和凋亡抑制蛋白XIAP的表达水平，最终影响CML细胞的非依赖性耐药。　　第四部分 CRISPR/Cas9构建KMT2CK339N K562细胞模型及相关机制研究　　目的:　　构建KMT2CK339N K562细胞模型，进一步明确相关机制。　　方法:　　1.采用CRISPR/Cas9结合ssODN，构建KMT2CK339N K562细胞模型;　　2.使用CCK8细胞增殖实验、EdU细胞增殖实验和甲基纤维素克隆形成实验，进一步明确KMT2CK339N K562的细胞增殖情况;　　3.使用Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡实验，进一步明确KMT2CK339N K562的细胞凋亡情况;　　4.采用Real-time RT-PCR和Western Blot法，进一步明确KMT2C K339N突变与H3K4单甲基化及PI3K/AKT信号通路的关系;　　5.统计学处理:数据用均数±标准差描述，两样本定量资料的比较采用方差齐性检验和独立样本t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义，采用SPSS20.0进行统计分析。　　结果:　　1.使用CRISPR/Cas9，结合ssODN，将K562细胞定点敲入KMT2C K339N点突变，构建KMT2CK339N K562细胞模型;　　2.MMT2CK339N K562细胞增殖能力提高，而凋亡水平下降;　　3.KMT2CK339N K562细胞的H3K4的单甲基化水平下降，而PTEN、P21、BCL-2、BAX和P27的水平均明显下降，AKT Thr308、AKT Ser473和XIAP的水平明显升高，而PI3K p110α和AKT的表达水平无明显变化。　　结论:　　KMT2C K339N突变可影响自身组蛋白甲基转移酶功能，下调H3K4me1水平，进而抑制PI3K/AKT信号通路中负性调节因子PTEN的表达，上调AKT的磷酸化水平，影响CML细胞的凋亡和增殖，最终导致CML患者的BCR-ABL1酪氨酸激酶非依赖性耐药。