论文部分内容阅读
金黄色葡萄球菌作为人类主要病原细菌之一,具有较强的流行性、致病性和适应性。它能感染人体不同部位而导致多种感染性疾病,从常见的毛囊炎、溃疡等组织感染性疾病,到中毒性休克综合征、肺炎、心内膜炎、败血病、骨髓炎等致命性疾病。它的强致病性主要是胞内各种毒力因子及各种调控系统协同作用的结果。同时,在与环境或宿主的长期相互作用过程中,金黄色葡萄球菌进化出了非常灵敏完善的应答机制,具有极强的适应性。胞内二元信号系统、群体感应系统、sigma因子家族等一系列复杂而严密调控网络使细菌具备存活、引发感染、免疫逃逸等多方面能力。毒素-抗毒素系统广泛存在于细菌和古菌中,它们通常由含有一个影响细菌生长的毒素和一个能抵消毒素毒性的抗毒素组成的双顺反子基因元件构成。毒素-抗毒素系统不仅在维持质粒稳定、压力条件下控制细胞生长、导致细胞程序化死亡、持留性细胞形成等细菌应激反应中发挥功能,也能通过调控基因表达来影响细菌的生理行为,其毒素-抗毒素系统的调控功能主要由少数具有特异性识别序列的带有RNase活性的毒素蛋白完成。与其他细菌相似,金黄色葡萄球菌中也存在大量的毒素-抗毒素系统,但目前只有少数被鉴定,且生理功能研究极为缺乏。本研究阐述了一种由抗毒素介导的新型调控方式,抗毒素蛋白不仅能结合自身启动子进行自我调节,同时也能结合到其他靶基因的启动子对毒力基因进行调控,进而影响金黄色葡萄球菌的致病性。我们通过生物信息学分析,发现了金黄色葡萄球菌NCTC8325中的几对毒素-抗毒素系统并进行深入研究,其中由SAOUHSC02756-02757编码的SavRS的功能最为独特。SavRS被鉴定为金黄色葡萄球菌中II型TA系统,毒素SavS具有强细胞毒性能使细菌致死,抗毒素SavR与之形成稳定复合物抵消SavS的毒性使细菌在非压力条件下正常生长。凝胶阻滞分析实验和等温滴定微量热试验证明,SavR能做为抑制子结合到自身启动子调节savRS的转录,SavS能与之形成复合物SavRS增强与启动子的结合和转录抑制。DNaseI足迹实验证明,SavRS与启动子的结合序列中包含了一个序列为5’-TACGCTA****TAGCGTA-3’的长回文序列和一个序列为5’-ACT**AGT-3’的短回文序列。进一步对回文序列引入点突变后发现,回文序列对蛋白与DNA的结合和基因转录抑制至关重要。更有趣的是,敲除savRS后,突变菌株的溶血活性明显增强。我们通过实时定量PCR发现了突变菌株中毒力基因hla和efb的表达水平明显上升,其中hla编码能裂解红细胞的α溶血素,efb编码阻止血小板凝集的胞外纤连蛋白。进一步的凝胶阻滞分析实验证明,SavR和SavRS均能结合到savRS的启动子区域,从而抑制毒力基因的表达。最后,我们通过小鼠脓肿模型对savRS突变菌株的致病性进行了评估,savRS突变菌株能引起更严重的脓肿和感染,且在小鼠体内有更强的生存能力。这种新型的由抗毒素介导的调控方式不仅让我们对毒素-抗毒素的生理功能有了新的认识,同时也丰富了金黄色葡萄球菌中毒力因子调控网络。同时我们发现savS突变菌株明显降低了细菌在氨苄青霉素中持留性细胞的形成,通过对savS突变菌株进行转录组测序鉴定了一些表达水平有变化的基因。随后对这些基因进行了实时定量PCR进行验证,选取变化显著的rpmH基因进行过表达,并检测持留性细胞的形成。此外,我们对SAOUHSC02691-02692编码的毒素-抗毒素系统进行了鉴定,确定它为Ⅱ型毒素-抗毒素系统,且具有自我调节功能,能对毒素基因编码产生的细胞毒性进行调控。同时解析了复合物的晶体结构,检测了突变菌株的相关表型变化。