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研究目的动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是心脑血管疾病如心绞痛、心肌梗死、脑卒中等的共同病理基础,是危害生命健康最严重的病理生理过程之一,在发达国家被称之为“头号杀手”,近年来在我国的发生率也呈逐年上升的趋势。AS的发病机制复杂,从19世纪中叶到20世纪80年代,Duguid、Virchow、Steinberg等分别提出了血栓形成学说、脂质浸润学说、氧化学说,从不同角度解释了AS的形成机制。1999年,Ross提出损伤反应学说,认为动脉内膜损伤是AS病变发生的始动环节,随着对AS发生机制的深入研究,近年来这一学说得到了国内外研究学者的普遍共识。从中医角度来看, AS是一种由心脾肾亏损,导致气滞血瘀、痰积内生、脉络不通的全身性疾病,治疗常采用活血化瘀等具有综合调节功效的方剂,体现了中药复方多靶点、多通路、整体调节等独特优势,与AS发病机制的多样性相契合。银丹心脑通软胶囊(Yindan Xinnaotong capsule, YXC)是根据苗族医学“两病两纲”理论研制的复方制剂,由银杏叶、丹参、绞股蓝、灯盏细辛、大蒜、三七、山楂、天然冰片8味中药组成,具有活血化瘀、行气止痛、消食化滞等功效,临床上主要用于心脑血管疾病,其疗效肯定。针对AS的防治,目前,临床上除采用药物治疗、控制饮食等手段外,运动锻炼对AS的防治也日益受到人们的重视,运动可通过调节血流剪应力和血管内皮的功能,干预AS的发生发展过程。本研究首先采用高脂饲料、动脉结扎、腹腔注射维生素D3的复合方法建立AS大鼠模型,基于两因素三水平3×3析因设计,将YXC与运动联合应用,观察对大鼠左颈总动脉血管病理形态,血液流变学指标及血脂水平的影响,探讨YXC和运动联合之后预防大鼠动脉粥样硬化的作用；测定血浆中血管内皮细胞分泌的相关因子,采用免疫组织化学方法检测大鼠左颈总动脉SM22α的蛋白表达水平,从血管内皮细胞功能与血管重构两方面研究YXC和运动联合预防大鼠AS的作用机制。体外实验分别采用Ox-LDL、TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤两种模型, MTT法测定YXC预处理后HUVEC存活率,探讨YXC对内皮细胞的保护作用；采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定YXC预处理后,HUVEC中粘附分子的表达水平,采用流式细胞仪测定YXC对内皮细胞凋亡的影响,探讨YXC内皮保护的作用机制。为YXC的合理用药提供科学依据。研究内容1.YXC和运动联合作用对大鼠动脉粥样硬化的影响采用高脂饲料、结扎左颈总动脉、腹腔注射维生素D3的复合方法建立AS大鼠模型,按照二因素(YXC,游泳)三水平(0,1,2g-kg-1YXC;0,0.5,1h游泳)3×3析因设计对大鼠分组,实验共10组(9析因设计组,1假手术组)。8周后,腹主动脉采集血液测定血液流变学指标：血浆粘度、全血粘度(低切10s-、高切200s-1)、纤维蛋白原(Fibrinogen, FIB)、红细胞压积(Haematocrit,HCT)、凝血酶时间(。Thrombin time, TT),检测血清中血脂：总胆固醇(TotalCholesterol, T-CHO)、甘油三酯(Triglyceride, TG)、高密度脂蛋白胆固醇(High-density lipoprotein-cholesterol, HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(Low-density lipoprotein-cholesterol, LDL-C)的水平。同时固定大鼠左颈总动脉血管,苏木素-伊红(Hematoxylin and eosin stain, HE)染色,显微镜观察血管的病理变化情况。2.YXC与运动联合作用抗大鼠动脉粥样硬化机制的研究在大鼠造模并给予3×3析因设计干预措施8周后,腹主动脉取血测定血浆中一氧化氮(Nitric oxide, NO)、6-酮-前列腺素Iα(6-keto-prostaglandin F1α,6-keto-PGF1α)、内皮素(Endothelin,ET)、血栓烷素B2(Thromboxane B2, TXB2)水平；同时固定大鼠左颈总动脉血管,DP2-BSW图像分析软件,在血管横切面上测量血管的内径、壁厚以及壁厚内径比(壁厚内径比=管壁厚/管径),观察不同干预措施对AS大鼠血管结构的影响,然后进行免疫组织化学染色,观察蛋白SM22a的阳性表达,并计算相对阳性表达量,观察不同组对血管功能性重构的影响。3.YXC对Ox-LDL和TNF-a诱导的脐静脉内皮细胞损伤的保护作用研究体外培养人脐静脉内皮细胞(Human umilical vein endothelial cell, HUVEC), MTT法确定YXC的最大无毒浓度和实验浓度；同法测定肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-a, TNF-a)的造模浓度：氧化低密度脂蛋白(Oxidized LDL, Ox-LDL)的造模浓度参考相关文献。MTT法测定YXC预孵育后,对Ox-LDL和TNF-a诱导HUVEC的生存率影响。200μg·ml-1Ox-LDL和60ng·m-1TNF-α造模,ELISA法测定细胞上清液中的细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)和血小板内皮细胞粘附分子-1(Platelet endothelial cell adhesion molecular-1, PEC AM-1)水平。体外培养HUVEC, YXC预处理后,200μg·mL-1Ox-LDL造模,Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术测定不同组细胞凋亡情况。实验结果1,YXC和运动联合作用对大鼠动脉粥样硬化的影响(1)对AS斑块的影响YXC与游泳可减轻动脉血管壁钙化、减少胆固醇结晶,2g·kg-1YXC和游泳对血管病变的改善较优；(2)对血液流变学指标的影响在降低血浆粘度、高低切全血粘度、FIB方面,YXC和游泳显示明显交互作用(p<0.05),2g·kg-1YXC和O h游泳对血浆粘度、高切全血黏度、HCT的降低优于其他组；(3)对血脂水平的影响YXC和游泳在降低血清中T-CHO、LDL-C、TG的水平方面具有明显的交互作用(p<0.05), YXC升高HDL-C主效应明显(F=4.095,p=0.023)。2.YXC与运动联合作用抗大鼠动脉粥样硬化机制的研究(1)对血管内皮因子的影响YXC和游泳在升高内皮因子NO、6-keto-PGF1α水平方面交互作用显著(p<0.05),在降低ET、 TXB2水平上,交互作用显著(p<0.05)；(2)对血管重构的影响YXC和游泳在降低壁厚和壁厚内径比方面,交互作用显著(p<0.05)；YXC和游泳可升高蛋白SM22a的表达,交互作用不明显(F=I.632,p=0.175),单独游泳的主效应明显(F=8.088,p=0.001)3. YXC对Ox-LDL和TNF-a诱导的HUVEC损伤的保护作用(1)YXC的最大无毒浓度为500μg·mL-1,将250μg·mL-1.125μg·mL-1、62.5μg·mL-1三个浓度作为YXC的实验浓度；TNF-α的造模浓度选择60ng·mL-1,作用时间为24h；(2)对细胞生存率的影响YXC孵育24h后可明显升高Ox-LDL诱导的HUVEC的存活率(p<0.05),具有明显的量效关系； YXC孵育24h后可明显升高TNF-α诱导的HUVEC的存活率(p<0.05),且当浓度大于125μg·mL-1时,量效关系明显。(3)对粘附分子分泌的影响YXC可显著降低Ox-LDL诱导的HUVEC损伤模型中PECAM-1的含量(p<0.05)和ICAM-1的含量(p<0.05)；YXC可显著降低TNF-α诱导的HUVEC损伤模型中ICAM-1、PECAM-1含量(p<0.05)；(4)对Ox-LDL诱导的HUVEC细胞凋亡的影响YXC可降低Ox-LDL诱导的HUVEC模型中细胞的凋亡率,抑制细胞凋亡。结论1.YXC与游泳联合应用具有预防大鼠AS的作用,其作用环节可能与改善血液流变学指标、降低血脂水平、保护血管内皮功能、抑制血管重构有关。2.YXC对Ox-LDL和TNF-α诱导的HUVEC损伤具有保护作用,其机制可能与减少ICAM-1、PECAM-1的分泌,抑制细胞凋亡有关。