透明质酸(hyaluronic acid,HA)是一种高分子聚合物,由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖胺以β-1,3和β-1,4糖苷键相连的二糖单位重复构建而成。由于特殊的生理作用、独特的流变学特性和极强的持水保湿能力,透明质酸在化妆品工业、医学研究、临床治疗等领域有广泛的应用。目前,透明质酸的生产逐渐由动物组织提取法转向微生物发酵法。然而,现有发酵所采用的链球菌大多数既产HA,也产透明质酸分解酶(Hyaluronate Lyase,简称Hyl) ,这导致了HA发酵的产率低分子量也比较小。因此,选育Hyl缺陷型菌株是HA高产菌株选育过程中极重要的一步。近年来,随着一些透明质酸分解酶基因(Hyl)序列的报道,根据基因工程原理利用基因敲除的方法获得Hyl缺陷型菌株,越来越被人们重视。本研究即根据GenBank中公布的兽疫链球菌Hyl基因序列设计引物,扩增获得了整个基因序列,然后将其克隆到载体pBR322上,经测序及序列比对,该片段与GenBank中公布的Hyl基因序列同源性达98%。根据出发菌的Hyl基因序列设计引物扩增获得了部分透明质酸分解酶基因(Hyl-1)。然后将其克隆到载体pMD19-T上,再以质粒pUC19为模板,PCR扩增得到氨苄青霉素抗性基因,通过反向PCR将其插入Hyl-1基因的中部,得到基因敲除载体pMD19T-SA。该载体与质粒pBR322分别用EcoR I、Pst I双酶切后进行连接,得到基因敲除载体pBR322-SA,经PCR及限制性酶切分析,两种敲除载体均与设计结果相符。分别用线性化与非线性化的改造质粒转化兽疫链球菌感受态细胞,用氨苄青霉素抗性平板进行初筛,通过转化子对抗生素耐受性实验,氨苄青霉素浓度确定为4μg/mL,结果共获得85个明显的单菌落。将其分别在不含抗生素的液体和固体培养基中重复转接和培养6次后,再通过氨苄青霉素抗性平板筛选,结果获得2株阳性转化子。进一步对阳性转化子进行PCR验证及酶活测定,2株转化子的酶活分别为2.1U与1.2U,均低于原出发菌株的48.0U水平。结果表明本研究最终得到2株由Hyl基因失活导致透明质酸分解酶活力下降的重组菌。本文为利用基因工程手段获得可应用于工业生产的兽疫链球菌提供了研究方向。为进一步利用微生物发酵法生产HA,提高HA产量及分子量打下了基础。