凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是世界对虾养殖的主要品种。近年来，受全球性气候变暖的影响，天气持续高温导致对虾患病及死亡率明显增加，凡纳滨对虾高温胁迫的研究越来越受关注。本论文以凡纳滨对虾为实验对象，对高温胁迫下凡纳滨对虾肝胰腺组织进行转录组测序研究，筛选获得与抗高温胁迫相关的基因，并进一步对这些基因的功能进行了初步探究。为凡纳滨对虾的环境适应性调控机制提供重要的数据支持，同时也为凡纳滨对虾耐高温新品种的培育提供理论参考。
　　研究内容包括以下3个部分：
　　1.高温胁迫下凡纳滨对虾肝胰腺的转录组分析
　　设计高温渐变实验和高温骤变实验。高温渐变实验：从26℃按每12h升高1℃速度升温至38℃，之后按每12h降低1℃速度回温至26℃，分别在升温前26℃(A26)、升温至38℃12h(B38)、回温至26℃12h(C26)取肝胰腺。高温骤变实验：从26℃水中直接放入36℃水中，24h后，再从36℃水中返回26℃水中，分别在升温前26℃(A26)、骤变至36℃10min(D36)、骤变至36℃24h(E36)、回温至26℃(F26)取肝胰腺，进行转录组测序。构建6组样品间转录组对比(即A26vsB38、B38vsC26、A26vsD36、D36vsF26、A26vsE36和E36vsF26)。上述6组间存在10个共有的上调差异表达基因，其中有具体注释的有9个，分别为：hotshockprotein70(Hsp70)、hsp70-bindingprotein1(HspBP1)、trehalose-6-phosphatesynthase(TPS)、halfpint(Hfp)、dnadamage-inducibletranscript4-likeprotein(Ddit4l)、luc7-likeprotein3(Luc7L3)、peritrophin-1-like(Pl)、perlucin-likeprotein(Plp)、arylsulfataseA(Arsa)。根据已有研究选择Hsp70(Lv-Hsp70)、HspBP1(Lv-HspBP1)和TPS(LvTPS)3个基因进行深入研究。
　　2.高温胁迫下凡纳滨对虾Hsp70、HspBP1和TPS三个基因的表达特征
　　基于转录组数据筛选出Hsp70、HspBP1、TPS三个基因的序列，利用RT-PCR技术获得这三个基因完整的ORF，分别编码629、325和842个氨基酸，对这三个基因进行氨基酸序列、多序列比对及进化树等生物信息学分析，结果表明本研究所获得的序列为Hsp70、HspBP1、TPS序列。
　　利用qRT-PCR技术分析Lv-Hsp70在高温渐变和高温骤变两个实验过程6个不同组织(鳃、肝胰腺、眼柄、心脏、神经和肌肉)的表达情况。结果显示，26℃时，Lv-Hsp70在凡纳滨对虾6种组织中均有表达，其中在眼柄中表达量为最高，神经表达量次之，鳃、肝胰腺和心脏表达量基本相同，仅次于神经；肌肉表达量为最低；但6种组织间表达量变化没有差异性显著。在高温渐变下，与对照组(26℃)下的凡纳滨对虾相比，水温升至32℃时，肝胰腺和眼柄中Lv-Hsp70基因显著上调表达(P＜0.05)，心脏、神经和肌肉中Lv-Hsp70基因上调表达极显著(P＜0.01)；水温升至38℃时，鳃、肝胰腺、眼柄、神经和肌肉中Lv-Hsp70基因显著上调表达(P＜0.05)。随后随着温度的下降其表达量总体呈下调趋势。回温至32℃和26℃时，鳃中Lv-Hsp70基因表达量分别为下调极显著(P＜0.01)和显著下调(P＜0.05)，肝胰腺中Lv-Hsp70基因表达量均为显著下调(P＜0.05)，其他4种组织中Lv-Hsp70基因表达量变化无显著性差异。在高温骤变下，与对照组(26℃)下的凡纳滨对虾相比，水温骤变至36℃、10min时，鳃、肝胰腺和眼柄中Lv-Hsp70基因显著上调表达(P＜0.05)，神经中Lv-Hsp70基因上调表达极显著(P＜0.01)；至36℃、24h时，鳃、肝胰腺和肌肉中Lv-Hsp70基因显著上调表达(P＜0.05)，心脏中Lv-Hsp70基因上调表达极显著(P＜0.01)；但与36℃、10min相比，Lv-Hsp70在除肌肉外其他5种组织中表达量均下降。随后随着温度的下降其表达量总体呈下调趋势。回温至26℃时，鳃和眼柄中Lv-Hsp70基因表达量下调极显著(P＜0.01)，神经中Lv-Hsp70基因表达量上调极显著(P＜0.01)，其他3种组织中Lv-Hsp70基因表达量变化无显著性差异，但与36℃、24h时相比，Lv-Hsp70在6种组织中的表达量均下降。
　　利用qRT-PCR技术分析Lv-HspBP1在高温渐变和高温骤变两个实验过程6个不同组织(鳃、肝胰腺、眼柄、心脏、神经和肌肉)的表达情况。结果显示，26℃时，Lv-HspBP1在凡纳滨对虾6种组织中均有表达，且表达量基本相同，即Lv-HspBP1在6种组织中表达量变化无显著性差异(P＞0.05)。在高温渐变下，与对照组(26℃)下的凡纳滨对虾相比，水温升至32℃时，6种组织中Lv-HspBP1基因表达量变化不显著(P＞0.05)；水温升至38℃时，鳃和神经中Lv-HspBP1基因显著上调表达(P＜0.05)，眼柄、心脏和肌肉中Lv-HspBP1基因上调表达极显著(P＜0.01)。随后随着温度的下降其表达量总体呈下调趋势。回温至32℃时，神经中Lv-HspBP1基因显著上调表达(P＜0.05)，肝胰腺、心脏和肌肉中Lv-HspBP1基因上调表达极显著(P＜0.01)，但与38℃时相比，6种组织中Lv-HspBP1基因表达量均下降；回温至26℃时，鳃和心脏中Lv-HspBP1基因显著上调表达(P＜0.05)，其余4种组织中Lv-HspBP1基因表达量变化无显著性差异，与32℃时相比，6种组织中Lv-HspBP1基因表达基本相同，但与38℃时相比，6种组织中Lv-HspBP1基因表达量依旧为下降。在高温骤变下，与对照组(26℃)下的凡纳滨对虾相比，水温骤变至36℃、10min时，神经中Lv-HspBP1基因上调表达极显著(P＜0.01)；至36℃、24h时，肌肉中Lv-HspBP1基因显著上调表达(P＜0.05)，鳃、肝胰腺、心脏和神经中Lv-HspBP1基因上调表达极显著(P＜0.01)，但与36℃、10min相比，Lv-HspBP1在除肌肉外其他5种组织中表达量均下降。随后随着温度的下降其表达量总体呈下调趋势。回温至26℃时，眼柄、神经和肌肉中Lv-HspBP1基因表达量上调极显著(P＜0.01)，其他3种组织中Lv-HspBP1基因表达量变化无显著性差异，但与36℃、24h时相比，6种组织中Lv-HspBP1基因表达量均下降。
　　利用qRT-PCR技术分析LvTPS在高温渐变和高温骤变两个实验过程6个不同组织(鳃、肝胰腺、眼柄、心脏、神经和肌肉)的表达情况。结果显示，26℃时，LvTPS在凡纳滨对虾6种组织中均有表达，鳃和肌肉表达量基本相同，为最高；眼柄、心脏和神经表达量次之，显著低于鳃和肌肉中表达量(P＜0.05)；肝胰腺中表达量为最低，显著低于其他5种组织中表达量(P＜0.05)。在高温渐变下，与对照组(26℃)下的凡纳滨对虾相比，水温升至32℃时，眼柄和心脏中LvTPS基因显著上调表达(P＜0.05)；水温升至38℃时，鳃、肝胰腺、眼柄和心脏中LvTPS基因显著上调表达(P＜0.05)。其中在肝胰腺中表达量变化比较显著。随后随着温度的下降其表达量总体呈下调趋势。回温至32℃和26℃时，6种组织中LvTPS基因表达量与对照组均无显著性差异。在神经和肌肉中，不同温度胁迫下的LvTPS基因表达量没有显著变化。在高温骤变下，以26℃条件下的凡纳滨对虾为对照组，水温骤变至36℃、10min时，肝胰腺、心脏和神经中LvTPS基因显著上调表达(P＜0.05)，鳃中LvTPS基因上调表达极显著(P＜0.01)；至36℃、24h时，鳃中LvTPS基因显著上调表达(P＜0.05)，肝胰腺和神经中LvTPS基因上调表达极显著(P＜0.01)；但与36℃、10min相比，LvTPS在6种组织中表达量均下降。随后随着温度的下降其表达量总体呈下调趋势。回温至26℃时，其中眼柄中LvTPS基因显著上调表达(P＜0.05)，而神经和鳃中LvTPS基因分别显著下调表达(P＜0.05)和极显著下调表达(P＜0.01)，其他3种组织中LvTPS基因表达量变化无显著性差异。
　　3、高温胁迫下凡纳滨对虾TPS基因功能的初步研究
　　采用RNAi技术抑制LvTPS基因的表达对凡纳滨对虾进行高温胁迫实验，结果显示干扰组0-48h累积死亡率较对照组显著增高(P＜0.05)，同时发现凡纳滨对虾死亡率与干扰效果成正比，即受到高温胁迫时，干扰效率越高，凡纳滨对虾死亡率越高。进一步明确了LvTPS基因在凡纳滨对虾响应高温胁迫中发挥着重要作用，为凡纳滨对虾耐高温胁迫抗性品种选育提供一定的理论参考。