凡纳滨对虾高温胁迫相关基因的筛选与分析

来源 :大连海洋大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:qpalzm951
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凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是世界对虾养殖的主要品种。近年来,受全球性气候变暖的影响,天气持续高温导致对虾患病及死亡率明显增加,凡纳滨对虾高温胁迫的研究越来越受关注。本论文以凡纳滨对虾为实验对象,对高温胁迫下凡纳滨对虾肝胰腺组织进行转录组测序研究,筛选获得与抗高温胁迫相关的基因,并进一步对这些基因的功能进行了初步探究。为凡纳滨对虾的环境适应性调控机制提供重要的数据支持,同时也为凡纳滨对虾耐高温新品种的培育提供理论参考。
  研究内容包括以下3个部分:
  1.高温胁迫下凡纳滨对虾肝胰腺的转录组分析
  设计高温渐变实验和高温骤变实验。高温渐变实验:从26℃按每12h升高1℃速度升温至38℃,之后按每12h降低1℃速度回温至26℃,分别在升温前26℃(A26)、升温至38℃12h(B38)、回温至26℃12h(C26)取肝胰腺。高温骤变实验:从26℃水中直接放入36℃水中,24h后,再从36℃水中返回26℃水中,分别在升温前26℃(A26)、骤变至36℃10min(D36)、骤变至36℃24h(E36)、回温至26℃(F26)取肝胰腺,进行转录组测序。构建6组样品间转录组对比(即A26vsB38、B38vsC26、A26vsD36、D36vsF26、A26vsE36和E36vsF26)。上述6组间存在10个共有的上调差异表达基因,其中有具体注释的有9个,分别为:hotshockprotein70(Hsp70)、hsp70-bindingprotein1(HspBP1)、trehalose-6-phosphatesynthase(TPS)、halfpint(Hfp)、dnadamage-inducibletranscript4-likeprotein(Ddit4l)、luc7-likeprotein3(Luc7L3)、peritrophin-1-like(Pl)、perlucin-likeprotein(Plp)、arylsulfataseA(Arsa)。根据已有研究选择Hsp70(Lv-Hsp70)、HspBP1(Lv-HspBP1)和TPS(LvTPS)3个基因进行深入研究。
  2.高温胁迫下凡纳滨对虾Hsp70、HspBP1和TPS三个基因的表达特征
  基于转录组数据筛选出Hsp70、HspBP1、TPS三个基因的序列,利用RT-PCR技术获得这三个基因完整的ORF,分别编码629、325和842个氨基酸,对这三个基因进行氨基酸序列、多序列比对及进化树等生物信息学分析,结果表明本研究所获得的序列为Hsp70、HspBP1、TPS序列。
  利用qRT-PCR技术分析Lv-Hsp70在高温渐变和高温骤变两个实验过程6个不同组织(鳃、肝胰腺、眼柄、心脏、神经和肌肉)的表达情况。结果显示,26℃时,Lv-Hsp70在凡纳滨对虾6种组织中均有表达,其中在眼柄中表达量为最高,神经表达量次之,鳃、肝胰腺和心脏表达量基本相同,仅次于神经;肌肉表达量为最低;但6种组织间表达量变化没有差异性显著。在高温渐变下,与对照组(26℃)下的凡纳滨对虾相比,水温升至32℃时,肝胰腺和眼柄中Lv-Hsp70基因显著上调表达(P<0.05),心脏、神经和肌肉中Lv-Hsp70基因上调表达极显著(P<0.01);水温升至38℃时,鳃、肝胰腺、眼柄、神经和肌肉中Lv-Hsp70基因显著上调表达(P<0.05)。随后随着温度的下降其表达量总体呈下调趋势。回温至32℃和26℃时,鳃中Lv-Hsp70基因表达量分别为下调极显著(P<0.01)和显著下调(P<0.05),肝胰腺中Lv-Hsp70基因表达量均为显著下调(P<0.05),其他4种组织中Lv-Hsp70基因表达量变化无显著性差异。在高温骤变下,与对照组(26℃)下的凡纳滨对虾相比,水温骤变至36℃、10min时,鳃、肝胰腺和眼柄中Lv-Hsp70基因显著上调表达(P<0.05),神经中Lv-Hsp70基因上调表达极显著(P<0.01);至36℃、24h时,鳃、肝胰腺和肌肉中Lv-Hsp70基因显著上调表达(P<0.05),心脏中Lv-Hsp70基因上调表达极显著(P<0.01);但与36℃、10min相比,Lv-Hsp70在除肌肉外其他5种组织中表达量均下降。随后随着温度的下降其表达量总体呈下调趋势。回温至26℃时,鳃和眼柄中Lv-Hsp70基因表达量下调极显著(P<0.01),神经中Lv-Hsp70基因表达量上调极显著(P<0.01),其他3种组织中Lv-Hsp70基因表达量变化无显著性差异,但与36℃、24h时相比,Lv-Hsp70在6种组织中的表达量均下降。
  利用qRT-PCR技术分析Lv-HspBP1在高温渐变和高温骤变两个实验过程6个不同组织(鳃、肝胰腺、眼柄、心脏、神经和肌肉)的表达情况。结果显示,26℃时,Lv-HspBP1在凡纳滨对虾6种组织中均有表达,且表达量基本相同,即Lv-HspBP1在6种组织中表达量变化无显著性差异(P>0.05)。在高温渐变下,与对照组(26℃)下的凡纳滨对虾相比,水温升至32℃时,6种组织中Lv-HspBP1基因表达量变化不显著(P>0.05);水温升至38℃时,鳃和神经中Lv-HspBP1基因显著上调表达(P<0.05),眼柄、心脏和肌肉中Lv-HspBP1基因上调表达极显著(P<0.01)。随后随着温度的下降其表达量总体呈下调趋势。回温至32℃时,神经中Lv-HspBP1基因显著上调表达(P<0.05),肝胰腺、心脏和肌肉中Lv-HspBP1基因上调表达极显著(P<0.01),但与38℃时相比,6种组织中Lv-HspBP1基因表达量均下降;回温至26℃时,鳃和心脏中Lv-HspBP1基因显著上调表达(P<0.05),其余4种组织中Lv-HspBP1基因表达量变化无显著性差异,与32℃时相比,6种组织中Lv-HspBP1基因表达基本相同,但与38℃时相比,6种组织中Lv-HspBP1基因表达量依旧为下降。在高温骤变下,与对照组(26℃)下的凡纳滨对虾相比,水温骤变至36℃、10min时,神经中Lv-HspBP1基因上调表达极显著(P<0.01);至36℃、24h时,肌肉中Lv-HspBP1基因显著上调表达(P<0.05),鳃、肝胰腺、心脏和神经中Lv-HspBP1基因上调表达极显著(P<0.01),但与36℃、10min相比,Lv-HspBP1在除肌肉外其他5种组织中表达量均下降。随后随着温度的下降其表达量总体呈下调趋势。回温至26℃时,眼柄、神经和肌肉中Lv-HspBP1基因表达量上调极显著(P<0.01),其他3种组织中Lv-HspBP1基因表达量变化无显著性差异,但与36℃、24h时相比,6种组织中Lv-HspBP1基因表达量均下降。
  利用qRT-PCR技术分析LvTPS在高温渐变和高温骤变两个实验过程6个不同组织(鳃、肝胰腺、眼柄、心脏、神经和肌肉)的表达情况。结果显示,26℃时,LvTPS在凡纳滨对虾6种组织中均有表达,鳃和肌肉表达量基本相同,为最高;眼柄、心脏和神经表达量次之,显著低于鳃和肌肉中表达量(P<0.05);肝胰腺中表达量为最低,显著低于其他5种组织中表达量(P<0.05)。在高温渐变下,与对照组(26℃)下的凡纳滨对虾相比,水温升至32℃时,眼柄和心脏中LvTPS基因显著上调表达(P<0.05);水温升至38℃时,鳃、肝胰腺、眼柄和心脏中LvTPS基因显著上调表达(P<0.05)。其中在肝胰腺中表达量变化比较显著。随后随着温度的下降其表达量总体呈下调趋势。回温至32℃和26℃时,6种组织中LvTPS基因表达量与对照组均无显著性差异。在神经和肌肉中,不同温度胁迫下的LvTPS基因表达量没有显著变化。在高温骤变下,以26℃条件下的凡纳滨对虾为对照组,水温骤变至36℃、10min时,肝胰腺、心脏和神经中LvTPS基因显著上调表达(P<0.05),鳃中LvTPS基因上调表达极显著(P<0.01);至36℃、24h时,鳃中LvTPS基因显著上调表达(P<0.05),肝胰腺和神经中LvTPS基因上调表达极显著(P<0.01);但与36℃、10min相比,LvTPS在6种组织中表达量均下降。随后随着温度的下降其表达量总体呈下调趋势。回温至26℃时,其中眼柄中LvTPS基因显著上调表达(P<0.05),而神经和鳃中LvTPS基因分别显著下调表达(P<0.05)和极显著下调表达(P<0.01),其他3种组织中LvTPS基因表达量变化无显著性差异。
  3、高温胁迫下凡纳滨对虾TPS基因功能的初步研究
  采用RNAi技术抑制LvTPS基因的表达对凡纳滨对虾进行高温胁迫实验,结果显示干扰组0-48h累积死亡率较对照组显著增高(P<0.05),同时发现凡纳滨对虾死亡率与干扰效果成正比,即受到高温胁迫时,干扰效率越高,凡纳滨对虾死亡率越高。进一步明确了LvTPS基因在凡纳滨对虾响应高温胁迫中发挥着重要作用,为凡纳滨对虾耐高温胁迫抗性品种选育提供一定的理论参考。
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