过氧化物还原酶(Peroxiredoxin,Prx)是在生物体中广泛表达的一类新的抗氧化蛋白家族,在进化上高度保守,参与调节细胞内信号传导、增殖、分化、凋亡及免疫细胞毒等进程,对于生物体维持正常生命活动起关键作用。七鳃鳗作为脊椎动物最直接的祖先,在进化上因连接着脊椎与无脊椎动物而具有极高的研究价值,为深入探索脊椎动物的起源与进化提供了丰富的遗传信息。目前关于Prx的研究多集中在硬骨鱼及哺乳动物,七鳃鳗中是否存在Prx尚不明确。本论文利用分子生物学手段和生物信息学方法,从现存最古老的无颌类脊椎动物七鳃鳗(Lampetra japonica)口腔腺cDNA文库中搜索到一条Prx2同系物,对其基因进行克隆、进化和表达分析,可以揭示七鳃鳗Prx2基因与无脊椎动物和脊椎动物Prx2基因间的进化关系,有助于从分子水平上阐述脊椎动物Prx家族的起源和进化；此外,七鳃鳗口腔腺因分泌抗凝血剂、抗肿瘤剂以及麻醉剂而得到广泛关注,而七鳃鳗口腔腺分泌Prx2过氧化物酶活性的确定,使其有望成为潜在的抗氧化制剂,同时为进一步阐释七鳃鳗特有的寄生生活习性提供了理论依据。　　 本研究通过对日本七鳃鳗口腔腺cDNA文库1300多条有效EST序列进行生物信息学分析,发现一条能够翻译Prx2模体的开放阅读框,长594 bp,编码197个氨基酸,理论分子量21.7 kDa。具有典型的2-Cys Prx的两个氧化还原活性的半胱氨酸残基,且活性半胱氨酸残基周围保守模体分别为FFYPLDFTFVCPTEI和GEVCPA。七鳃鳗Prx2不含有信号肽和跨膜区。在氨基酸水平上,与脊椎动物Prx1和Prx2均具有70％以上的序列相似性。为了进一步说明七鳃鳗Prx2与Prx1和Prx2亚族的关系,构建基于邻接法的系统发育树,发现七鳃鳗Prx2与脊椎动物Prx2亚族构成一簇,而与Prx1亚族亲缘关系较远,说明克隆到的七鳃鳗Prx同系物属于Prx2亚族；此外,对七鳃鳗Prx2进化地位进行分析,发现七鳃鳗Prx2进化地位比较原始,与硬骨鱼Prx2亲缘关系较近,符合生物由低等到高等的客观自然进化规律。　　 利用基因工程手段,设计特异性引物,以GAPDH作为内参基因,Real-time PCR法检测Prx2 mRNA在七鳃鳗口腔腺、心脏、肝脏、肾脏、鳃、肠、红细胞和白细胞中的相对表达量,发现Prx2在七鳃鳗上述组织中广泛表达,且在红细胞中高丰度表达,进一步经脂多糖(LPS)刺激后,Prx2在红细胞中的表达量明显上调,具有统计学意义。以上结果说明Prx2与七鳃鳗红细胞抗氧化防御密切相关,对保护红细胞免受活性氧自由基的氧化损伤起重要作用；此外,Prx2在清除病原菌的防御反应中也发挥至关重要的作用。　　 进一步构建pET23b-Prx2原核表达载体,并在E.coli BL21中进行表达,组氨酸亲和层析柱纯化,获取七鳃鳗Prx2重组蛋白(recombinant L.japonica Prx2,rLj-Prx2)纯品。以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰兔,制备兔抗七鳃鳗血清Prx2蛋白多克隆抗体。对日本七鳃鳗口腔腺进行免疫组化染色,发现Prx2在七鳃鳗口腔腺的阳性表达区主要集中在上皮细胞和致密结缔组织细胞中。免疫印迹法进一步检测,发现自行制备的多克隆抗体能够与口腔腺天然分泌产物和重组蛋白均发生明显的特异性结合,说明Prx2蛋白不仅存在于口腔腺细胞中,同时也能被分泌到胞外,虽不含信号肽,却是一种分泌蛋白。这对于维持其特殊的寄生生活方式起重要作用,能够更好地抵抗来自宿主免疫防御系统和代谢过程中产生活性氧的攻击,形成保护机体免受氧化剂损伤的天然屏障。　　 对rLj-Prx2进行了体外过氧化物酶活性的检测。研究表明,rLj-Prx2有还原H2O2的解毒能力,且还原能力与重组蛋白的浓度成正比。同时这种还原活性是硫醇类物质依赖的,当反应体系中存在二硫苏糖醇(DTT)时,DTT作为供氢体将被氧化的rLj-Prx2还原,使之重新具有抗氧化生物学活性。进一步进行了DNA缺刻分析,构建DTT/Fe3+/O2混合功能氧化酶体系,发现在一些自由基如羟自由基对DNA造成损伤时,rLj-Prx2对超螺旋DNA也具有一定程度的保护作用。　　 日本七鳃鳗Prx2功能基因的表达解析及抗氧化活性的确定,有助于我们了解高保守的Prx2在生物进化过程中是如何不断完善自己的功能的,为深入了解七鳃鳗特殊生活习性和特殊进化地位奠定了基础,对进一步研究七鳃鳗机体新陈代谢和机体免疫功能具有重要意义。