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前言宫颈癌(cervical cancer,CC)是妇女最常见的恶性肿瘤之一,现已确认高危型人乳头瘤病毒(high risk human papillomavirus,HR-HPV)是宫颈癌形成最重要的危险因子,99.7%的浸润性宫颈癌中可以检测到HR-HPV的存在。因此,通过高危HPV的检测来筛查易患人群,追踪HPV感染状态,随访HPV是否被清除,是预防宫颈癌发生的关键。但并非所有感染HPV的患者都会发展为宫颈癌,仅检测到患者感染了HPV而不进一步检查就无法了解宫颈病变的程度和发展趋势。E-cadherin是一类介导细胞-细胞间黏附、具有维持组织结构完整性和极性的钙依赖性跨膜蛋白。E-cad的功能不仅需钙离子存在,还需要与其配体连接素(catenin,cat)结合成复合体才能起作用,β-cat与E-cad直接结合,α-cat介导E-cad/β-cat与细胞骨架的肌动蛋白相连。故对维持上皮细胞的极性及分化起到重要作用,E-cadherin功能下降或缺失可能导致细胞—细胞间黏附作用的降低,从而导致肿瘤的发生,发展.在宫颈上皮内病变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)和宫颈癌中呈低表达,在正常对照组高表达,因此如果通过对宫颈癌病因学因素HPV和生物标志物因素E-cadherin,β-catenin的联合检测,来对宫颈癌高危人群进行筛查,可能具有重要意义。本研究对93例宫颈液基细胞残液标本应用导流杂交HPV-DNA检测技术检测HPV各亚型的表达,并对相应组织组织学标本用免疫组化法检测E-cadherin,β-catenin,以探讨二者在子宫颈癌发生发展中的生物学意义及临床应用价值,试图为提高宫颈癌易患人群检出率,进而为宫颈癌的预警和早期诊断提供更科学有效的方法,达到早诊早治,降低宫颈癌发病率死亡率的目的;并为开发简便易得的分子筛查技术资源提供理论基础。材料和方法一、材料(一)研究对象600例宫颈液基细胞学残液标本,均经LCT(Liquid-based Cytology Test,LCT系统)诊为宫颈上皮内病变及宫颈癌,来自2007年9月～2008年10月中国医科大学附属第一医院妇科。无宫颈手术史、未孕、无盆腔放射治疗史,年龄26～77岁,平均年龄48.4岁。40例子宫颈癌、40例CIN患者及13例对照组其中子宫颈浸润癌40例、CINⅡ-Ⅲ19例、CINⅠ21例。(二)主要试剂、仪器和来源鼠抗人HPV16/18E6抗体和羊抗鼠IgG-HRP抗体,鼠抗人E-cadherin,β-catenin抗体均购自美国Santa Cruz公司。HPV-DNA分型检测试剂盒购自凯普公司。免疫组化S-P试剂盒和DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。二、方法(一)免疫组织化学染色用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法(S-P法)检测E-cadherin,β-catenin的表达。结果判定:E-cadherin,β-catenin蛋白定位于细胞膜,胞膜内见棕黄色颗粒为阳性。由3名有经验的病理医师在双盲法下独立计数。细胞涂片主要计数有病变的细胞,异常宫颈上皮细胞着色大于10%则判定为阳性标本。细胞片和组织片在光镜下根据着色范围分为:阳性细胞数小于10～24%为(+);阳性细胞数25～49%为(++);阳性细胞数50～74%为(+++);阳性细胞数大于75%为(++++)。(二)原位杂交检测HPV16/18DNA的表达。细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性。阳性细胞数小于25%为(+);阳性细胞数25%～49%为(++);阳性细胞数50%～74%为(+++);阳性细胞数75%～100%为(++++).(三)导流杂交HPV-DNA分型检测检测HPV-DNA各亚型的表达.在检测结果模板上相应亚型区域内出现实心圆点即为该亚型阳性表达.(四)westernHPV蛋白提取:将盛有样本的试管置于碎冰上,用超声破碎机破碎细胞,4℃12 000/g离心,45 min。取上清液,定量、备用。电泳、显色:采用十二烷基硫酸钠变性聚丙烯酰胺凝胶不连续缓冲系统,先后配制15%的分离胶和5%浓缩胶;取蛋白样品,上样20μl(约含蛋白60μg),电泳后将醋酸纤维素膜铺到胶上进行转印,42v,2h.加入一抗(1:200)过夜,加入二抗(1:2000)37℃,DAB显色3～5 min。该膜上有显色带出现为阳性;若无显色,为阴性表现。(五)统计学分析对所得结果各组间采用x~2检验及Fisher’s确切概率法检验,P＜0.05有统计学意义.结果一、免疫组化法检测E-cadherin,β-catenin的表达E-cadherin,在细胞膜内出现棕黄色颗粒为阳性,β-catenin在细胞膜内出现棕黄色颗粒为阳性,过表达时胞核胞浆均着色,周围正常结缔组织、血管、间质细胞显示弱的着色。E-cadherin,在正常宫颈脱落细胞及宫颈组织中高表达,在各组宫颈病变中有不同程度的表达:E-cadherin,在正常,CIN,浸润癌中的表达率分别为84.6%(11/13),72.5%(29/40),27.5%(11/40),β-catenin在正常,CIN,浸润癌中的表达率分别为76.9%(10/13),67.5%(27/40),32.5%(13/40)。随着宫颈上皮病变程度的加重呈现减低的趋势二、原位杂交法检测HPV16/18 DNA的表达HPV16/18在细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性,部分病例可在胞浆中见到棕黄色颗粒。HPV16/18在正常宫颈脱落细胞中及相应组织中不表达或弱表达,在各组宫颈病变中有不同程度的表达:在正常、CIN和宫颈癌中,HPV16/18的阳性率分别为15.4%(2/13)、50.0%(20/40)和82.5%(33/40),随着宫颈上皮病变程度的加重呈现增高的趋势。三、导流杂交HPV-DNA分型检测技术检测HPV各亚型的表达HPV-DNA各亚型在检测结果模板相应亚型区域内出现实心圆点,即为该亚型阳性.HPV-DNA各亚型在正常宫颈脱落细胞中不表达或弱表达,在各组宫颈病变中有不同程度的表达:600例患者HPV检测阳性共245例,阳性率为40.83%(245/600),其中包括复合感染,具体感染情况见表1.表2.在HPV21种亚型中,除了HPV43,HPV44外有19种亚型被检出,感染率最高的是HPV16(87/245),其它常见型别为HPV58(36/245),由此可见我省妇女感染HPV主要亚型是HPV16,HPV58及HPV6.四、Western法检测HPV16/18的表达HPV16/18在正常、CIN和宫颈癌中,阳性率分别为23.1%(3/13),62.5%(25/40),85%(34/40)。随着宫颈上皮病变程度的加重呈现增高的趋势。结论1.E-cadherin,β-catenin在宫颈上皮内病变及宫颈癌中,随着病变程度的加重而阳性率减低。2.HPV16/18的阳性率在宫颈上皮内病变及宫颈癌中,随着病变程度的加重而检出率增高。3.E-cadherin的表达和HPV16/18的感染在宫颈病变中呈负相关,二者联合检测可提高宫颈病变筛查的准确度。4.Western-blot检测HPV16/18E6具有较高的灵敏性,尤其是在CIN组,适合于对宫颈疑难病例的检测,作为HPV16/18检测的辅助手段。5.HPV16/18,在宫颈液基细胞学残液和相应组织中的检测结果都是基本一致的,作为宫颈病变检测的辅助手段。6.导流杂交HPV-DNA分型检测我省600例妇女感染HPV的阳性率为40.83%(245/600),感染的主要亚型是HPV16,HPV58及HPV6.