论文部分内容阅读
目的:通过体外实验观察沙利度胺对人小细胞肺癌细胞NCI-H446增殖及对血管内皮生长因子VEGF、缺氧诱导因子HIF-1α与核因子-κB(NF-κB)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)与金属蛋白酶组织抑制因子-3(TIMP-3)的影响,进一步阐明沙利度胺抗肿瘤、抗血管生成和诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制,同时观察沙利度胺联合VP-16对NCI-H446细胞的作用。方法:1选取人小细胞肺癌NCI-H446细胞系进行体外培养,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测沙利度胺不同浓度组(25、50、100μg/ml)、不同时间(24、48、72h)对NCI-H446细胞存活和生长的影响情况。流式细胞仪测定沙利度胺对NCI-H446细胞周期分布和凋亡的影响。2根据MTT的结果,设置对照组及实验组,应用免疫细胞化学(immunocytochemistry, IC)方法定性观察沙利度胺处理前后NCI-H446细胞中VEGF,HIF-1α和NF-κB蛋白的表达情况。采用流式细胞术(flowcytometry, FCM)定量检测沙利度胺处理前后NCI-H446细胞中VEGF、HIF-1α、MMP-1和TIMP-3蛋白表达的变化。3采用MTT比色法检测沙利度胺与抗癌药物依托泊苷联合应用后对NCI-H446细胞的增殖抑制作用,测定其吸光度(OD)值,并采用isobolanalysis公式分析相互作用指数(Iteraction Index),评价两药联合后的作用,如相互作用指数>1为两药物拮抗作用;相互作用指数=1为两药相加作用;相互作用指数<1为两药协同作用。4采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察沙利度胺与抗癌药物依托泊苷联合时不同序贯顺序对NCI-H446细胞的增殖抑制作用的影响。结果:1 MTT结果显示:沙利度胺在(25～100)μg/ml浓度范围内能明显抑制NCI-H446细胞体外增殖,随着时间、浓度增加,抑制率相应升高,以100μg/ml组作用72h抑制率最高。与对照组相比,不同浓度组对NCI-H446细胞抑制率差异均具有显著性统计学意义(P<0.01)。沙利度胺处理细胞48、72h,IC50分别为75.42μg/ml、40.62μg/ml。流式细胞仪检测NCI-H446细胞周期分布和凋亡显示,25、50、100μg/ml沙利度胺作用NCI-H446细胞48h,随药物浓度增大,G0/G1期细胞逐渐增多;S期和G2/M期细胞则逐渐减少。即沙利度胺可阻滞NCI-H446细胞周期进程于G1期,该作用呈剂量-效应依赖关系。25、50、100μg/ml沙利度胺处理细胞48h后,出现典型的亚二倍体凋亡峰,依沙利度胺浓度增大而逐渐升高;凋亡百分率分别为:4.56%、13.47%、19.12%、31.10%,较对照组有显著性统计学意义(P<0.01)。2免疫细胞化学检测结果显示:对照组NCI-H446细胞中,VEGF,HIF-1α和NF-κB染色阳性的细胞多,阳性细胞的胞浆呈现棕黄色颗粒,颗粒粗大;用药组染色强度明显减弱,颜色变淡,颗粒变细,阳性细胞数减少。与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。VEGF和HIF-1α成正相关(P<0.05),VEGF和NF-κB成正相关(P<0.05),HIF-1α和NF-κB成正相关(P<0.05)。流式细胞术检测结果显示:25、50、100μg/ml沙利度胺处理NCI-H446细胞48h后,NCI-H446细胞中VEGF蛋白表达荧光指数(FI值)分别为0.842、0.718、0.558,比较处理组和对照组的FI值,差异具有统计学意义(P<0.05)。NCI-H446细胞中HIF-1α蛋白表达荧光指数(FI值)分别为0.903、0.838、0.709,比较处理组和对照组的FI值,差异具有统计学意义(P<0.05)。NCI-H446细胞中MMP-1蛋白表达荧光指数(FI值)分别为0.849、0.733、0.599,比较处理组和对照组的FI值,差异具有统计学意义(P<0.05)。NCI-H446细胞中TIMP-3蛋白表达荧光指数(FI值)分别为1.663、2.110、2.677,比较处理组和对照组的FI值,差异具有统计学意义(P<0.05)。VEGF和MMP-1成正相关(P<0.05),VEGF和TIMP-3成负相关(P<0.05),MMP-1和TIMP-3成负相关(P<0.05)。3采用MTT比色法检测沙利度胺与抗癌药物依托泊苷联合应用后对NCI-H446细胞的增殖抑制作用,结果显示:沙利度胺可加强依托泊苷对NCI-H446细胞的增殖抑制作用。在0~100μg/ml范围内,随着沙利度胺浓度的增大,其对依托泊苷的协同作用增强。单用依托泊苷的IC50为1.66μg/ml,联合25、50μg/ml沙利度胺后可将依托泊苷的IC50分别降低至1.16、0.68μg/ml。因此,在一定浓度范围内,沙利度胺可协同依托泊苷抑制NCI-H446细胞的生长增殖。4 Isobolanalysis分析相互作用指数显示,沙利度胺联合依托泊苷在细胞生长抑制率为50%时的相互作用指数分别为0.55,证明沙利度胺确实可协同依托泊苷对NCI-H446细胞的增殖抑制作用。5采用MTT法观察沙利度胺与抗癌药物依托泊苷联合时不同序贯顺序对NCI-H446细胞的增殖抑制作用的影响,结果显示:作用顺序为先依托泊苷后沙利度胺的增殖抑制作用强于先沙利度胺后依托泊苷的增殖抑制作用,结果具有统计学意义(P<0.05)。结论:1本实验证实在一定浓度范围内,沙利度胺能够抑制NCI-H446人小细胞肺癌细胞增殖,并呈浓度-时间依赖关系。2本实验证实了沙利度胺可阻滞人小细胞肺癌细胞NCI-H446于G1期并可诱导该细胞凋亡,诱导细胞凋亡是其抗肿瘤作用机制之一。3一定浓度的沙利度胺能够抑制NCI-H446细胞中VEGF,HIF-1α和NF-κB,MMP-1的表达,增强TIMP-3的表达。VEGF和HIF-1α成正相关,VEGF和NF-κB成正相关,HIF-1α和NF-κB成正相关。VEGF和MMP-1成正相关,VEGF和TIMP-3成负相关,MMP-1和TIMP-3成负相关。4沙利度胺可协同依托泊苷对NCI-H446细胞的增殖抑制作用。5本实验证实了不同的药物序贯顺序对其协同作用有影响,作用顺序为先依托泊苷后沙利度胺的增殖抑制作用强于先沙利度胺后依托泊苷的增殖抑制作用,为序贯用药的顺序提供了理论依据。6本实验证实了沙利度胺具有抗小细胞肺癌的作用,并通过沙利度胺联合抗肿瘤药物的研究丰富了小细胞肺癌的治疗,为小细胞肺癌的综合治疗提供了新的选择。