研究背景:由于创伤、骨病或肿瘤引起的大段骨缺损是骨科临床上经常遇到的棘手问题之一,目前常用的方法是植骨术。移植物来源包括自体骨、同种异体骨、异种骨及各种无活性的人工骨等。自体骨移植存在来源有限、取骨处有并发症、二次手术等缺陷;同种异体骨有伦理、传播传染性疾病、免疫排斥及来源亦有限等;异种骨除了伦理、传播疾病之外,作为移植材料最大的障碍是免疫排斥;各种无活力的人工骨只是单纯的人工替代材料,存在降解困难或降解速率与骨生长速率不一致,影响成骨或机体功能。组织工程学的兴起为大段骨缺损的修复带来了新的希望。利用体外细胞培养技术将种子细胞扩增并和可降解的生物材料复合培养构建有生命活力的组织,植入体内修复缺损,重建骨的功能已不再是遥远的梦想。目前自体细胞来源的组织工程骨研究动物实验已取得了骄人的成绩,并已初步试用于临床,取得了一定的成功。然而,支架材料仍是制约组织工程骨大规模临床应用的瓶颈,制备来源丰富、价格低廉、性能优良的支架材料是研究热点之一。近年来国内外虽然有异种骨用于骨组织工程支架材料的许多研究,如Keil骨、Bio-Oss骨等,但没有完全解决异种骨的免疫原性及生物力学性能等问题。基于此,本实验以猪股骨为原料制备异种脱蛋白骨,在制备工艺上作了改进,主要是尽量保留胶原蛋白,去除非胶原蛋白、肽类、脂类及细胞等,在降低抗原性的同时保留力学强度,作了理化性能、生物安全性、细胞相容性及小型动物成骨等检测。并以制备的异种脱蛋白骨作为组织工程支架材料与山羊自体骨髓间充质干细胞复合,加入成骨性骨诱导因子rhBMP2构建组织工程骨修复山羊胫骨中下段20%节段性缺损,观察成骨能力和免疫排斥反情况,为异种脱蛋白骨作为组织工程支架材料进入临床提供实验依据。目的评估改良法制备异种脱蛋白骨(Xenogenic Deprotein Bone,XDPB)作为组织工程支架材料修复大动物长骨大段骨缺损的能力,并对XDPB的免疫原性,新生骨的数量、质量进行评价,为异种脱蛋白骨作为组织工程支架材料进入临床应用提供实验依据。方法(一)异种(猪)脱蛋白组织工程骨支架材料的改良制备和性能研究:参照改良法制备,将制备的脱蛋白骨放入-80℃超低温冰箱冷冻3月后取出,真空包装,Co60照射后置-20℃保存。计算每块脱蛋白骨的平均质量、大小,扫描电镜观察并测定材料的孔径和孔隙率,氨基酸分析仪检测氨基酸种类和含量,万能生物力学测试仪检测材料的抗压缩、三点抗弯曲等力学指标。部分脱蛋白骨块于术前浸入含rhBMP2浓度为75ng/ml溶液中2h备用。(二)山羊MSCs培养、鉴定及生物学特性检测。1.MSCs培养:在山羊髂骨处用骨穿针穿刺抽取约10ml骨髓,分离MSCs,培养、收集细胞。2. MSCs生物学特性观察:活细胞动态观察、倍增时间;3.MSCs定向诱导分化:第二代细胞进行成骨、成脂诱导培养及钙染色、脂肪染色、ALP染色、ALP活性测定和Ⅰ型胶原、骨钙素免疫组化染色等。(三)异种脱蛋白骨支架材料的细胞相容性研究。1.异种脱蛋白骨支架材料与山羊骨髓间充质干细胞的复合培养:倒置镜、扫描电镜观察细胞在材料表面、孔隙内附着、生长和增殖情况。2.异种脱蛋白骨构建组织工程骨植入大动物体内的免疫学研究:山羊24只,分两组,自体骨对照组6只(自体骨)和实验组18只(异种脱蛋白骨),分别于术后0、3、7、14、28、56天抽外周血,流式细胞仪检测细胞免疫和ILISA检测体液免疫指标。3.在体支架材料内BrdU标记自体MSCs增殖的大动物示踪研究:培养山羊MSCs,传至第三代,细胞同步化后加入BrdU培养。观察BrdU标记的MSCs形态,将BrdU标记的MSCs与XDPB复合培养7天后植入山羊自体内,术后4周处取出移植材料检测标记细胞。(四)异种脱蛋白骨构建组织工程骨修复山羊胫骨大段骨缺损的临床观察:山羊24只,分4组,每组6只,在每只山羊左侧胫骨中下段造成胫骨总长度20%节段性骨缺损,据不同植入材料不同命名为A组(单纯XDPB)、B组(XDPB+自体MSCs)、C组(自体骨)及D组(XDPB+自体MSCs+rhBMP2),采用半环槽式外固定器固定。术后即时、4、8、12、16、20、24周对各组山羊进行摄X片,24周处死山羊取右侧胫骨进行双能X线(DEXA)、血管化、生物力学和组织学检测。结果(一)异种(猪)脱蛋白组织工程骨支架材料的改良制备和性能研究:新制备的XDPB块肉眼观呈白色,略带黄色,长条状,质硬脆,见大量蜂窝状孔隙。光镜下见骨块疏松多孔,孔隙较规则,孔中残留物少。扫描电镜该材料具有原始骨小梁、小梁间隙及骨内管腔系统,具有天然的网孔结构,平均孔径(386.55±25.64)μm,孔隙率(75.33±2.35)%。氨基酸分析胶原类氨基酸(Gly、Arg、Lys)波峰较高,芳香簇氨基酸酪氨酸(Tyr)和半胱氨酸(Cys)波峰消失。力学检测除弹性模量升高外,抗压缩、三点抗弯曲破坏载荷及破坏极限载荷与新鲜骨差异无统计学意义。(二)山羊MSCs培养、鉴定及生物学特性检测:1.MSCs培养:原代MSCs接种后1～2天开始贴壁,5～6天形成集落,12～14天长成单层,绝大部分细胞呈梭形,形态均一,分布不均。传代细胞2～4小时完成贴壁,5～6天铺满瓶底,形态更加单一,均匀分布,排列成有规则的方向性。细胞数量在第3天明显增加,第6天达峰,倍增时间为35.5小时。2. MSCs鉴定:成骨诱导培养10～12天形成圆形或卵圆形钙化结节,ALP染色染成灰黑色,核固红染色呈红色结节状,Ⅰ型胶原、骨钙素免疫组化染色细胞浆内有大量黄色颗粒。成脂诱导培养10～12天出现圆形脂肪小滴,油红O染色呈桔黄色脂肪滴。(三)异种脱蛋白骨支架材料的相容性研究。1.异种脱蛋白骨支架材料的与山羊骨髓间充质干细胞的复合培养:倒置镜、扫描电镜观察显示山羊MSCs在材料孔隙内生长、分化增殖,在相同时间点细胞增殖测定显示细胞增殖峰值、细胞数量与单纯培养组差异无统计学意义(P>0.05)。2.异种脱蛋白骨构建组织工程骨植入大动物体内的免疫学研究:异种脱蛋白骨植入组细胞免疫指标在术后3天和7天有轻度升高,14天以后逐渐下降,自体骨组无明显变化,在同一时间点统计学分析两组差异无统计学意义(P>0.05)。体液免疫指标术后无明显变化。3.在体支架材料内BrdU标记自体MSCs增殖的大动物示踪研究: XDPB复合BrdU标记的山羊自体MSCs植入术后4周,免疫荧光检测可见BrdU标记细胞在XDPB网孔内生长增殖。(四)异种脱蛋白骨构建组织工程骨修复山羊胫骨大段骨缺损的动物实验研究:异种脱蛋白骨构建组织工程骨修复山羊胫骨大段骨缺损:术后1～15周,空白对照组骨缺损处无骨形成,随时间延长出现骨端硬化,髓腔闭合。术后1～24周,实验组表现为:在同一时间点, X线、骨密度、生物力学、血管化水平和组织学,C组>D组>B组>A组,D组与C组比较差异无统计学意义(P>0.05),A、B组与C、D组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.本改良法制备的XDPB支架不引起明显细胞和体液免疫反应,有良好的相容性;2.通过BrdU细胞标记技术显示,自体MSCs在DPHP内良好存活、生长并成骨;3.改良法制备异种脱蛋白骨能够作为组织工程支架修复山羊胫骨大段骨缺损;4.本法制备的异种脱蛋白骨的免疫原性低,不影响自体MSCs成骨,若再结合rhBMP2,其成骨能力与自体骨相当。5.单纯XDPB修复骨缺损能力最差,B组其次,复合自体MSCs和rhBMP2组成骨能力和自体骨相当。