论文部分内容阅读
睾丸发育特异性蛋白-27基因（Testis development specific protein gene 27,NYD-SP27）是磷脂酶C（phospholipase C,PLC）的亚型,属于一种内源性的去能因子,对于精子发生、获能、顶体反应以及受精过程中起着抑制作用。目前,相关NYD-SP27的研究在人类和小鼠方面有相关报道,在绵羊方面则未见相关报道。目的:本研究以绵羊为研究对象,应用分子生物学技术克隆NYD-SP27基因序列,并构建NYD-SP27基因干扰载体,利用外科学方法将NYD-SP27基因干扰载体质粒注入公绵羊睾丸后,采集公羊精液,通过体外受精方法,研究NYD-SP27基因的干扰后对绵羊精卵受精和早期胚胎发育中的生物学作用,以揭示NYD-SP27基因的作用机制提供科学依据。方法:（1）从绵羊睾丸组织中提取RNA,通过试剂盒反转录成cDNA并以其为模板,用PCR扩增并分析绵羊NYD-SP27基因序列;（2）将扩增的NYD-SP27基因克隆至pLL3.7中,构建真核干扰表达载体并进行大提质粒,并将干扰载体质粒注入绵羊睾丸组织内,然后采用电刺激采精法进行采精,进行精液的常规检查后,精液涂片经甲醛固定后在荧光显微镜下观察精子情况;（3）为了验证NYD-SP27基因的干扰效果,从已注射NYD-SP27基因干扰载体的活体公羊睾丸组织中提取RNA反转录成cDNA后进行半定量PCR验证;（4）为了研究NYD-SP27基因干扰对绵羊体外受精效果的影响,采集绵羊卵母细胞并在体外成熟培养后进行体外受精,比较和分析对照组和NYD-SP27基因干扰组的体外受精效果和早期胚胎发育的影响。结果与结论:（1）成功克隆并获得了NYD-SP27基因全长序列。结果表明,NYD-SP27基因的全长1 901bp,其中只含有1617 bp组成的开放阅读框（ORF）,其起始密码子为ATG,终止密码子为TAG,共编码538个氨基酸（图1-7）;相对分子质量6 1995.66,理论PI值为6.16,正电荷残基数（Arg+Lys）为61,负电荷残基数（Asp+Glu）为67;分子式C2798H4319N737O819S19;体外半衰期为30 h,不稳定系数46.96（不稳定）;总平均吸水性-0.403;（2）将NYD-SP27干扰载体质粒注入到绵羊睾丸组织后,采集精液在荧光显微镜下成功观察到绿色荧光;NYD-SP27基因表达产物经半定量PCR琼脂糖凝胶后,观察到的条带:试验组与对照组相比较扩增条带明显减弱。结果表明,体内的NYD-SP27基因被有效干扰;（3）体外受精结果为NYD-SP27组与对照组受精率分别为56%和20%,差异显著,早期胚胎发育率分别为55%和31%,差异显著,结果表明,NYD-SP27基因干扰可以有效提高绵羊精子体外受精率和促进早期胚胎发育。