膀胱癌(Bladder cancer，BC)是泌尿系统常见的恶性肿瘤。在世界范围内，膀胱癌发病率居恶性肿瘤的第5位，在欧美国家仅次于前列腺癌居泌尿系统恶性肿瘤的第二位[1-2]，而在国内，膀胱癌的发生率居泌尿系统恶性肿瘤的第一位[3]。目前，尽管对于膀胱癌的研究已经取得了巨大进步，一些与膀胱癌相关的癌基因和肿瘤抑制因子相继被发现[4]，但是其确切的发病机制仍然不是很清楚。　　随着人类后基因组计划和表观遗传学的进一步开展，占人类基因组99％的非编码序列越来越引起科学家的关注，其中最引人注目的是microRNA(miRNA)的发现。miRNA是发现于真核细胞中的一类长约19-24个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，miRNA具有茎环结构，在不同物种间具有保守性。成熟的miRNA通过miRNA诱导的基因沉默复合物(miRNA-induced gene silencing complex，miRISC)与靶mRNA的3非翻译区序列(untranslated regions，UTRs)结合发挥对蛋白质翻译的抑制或对靶mRNA的降解作用。最新研究结果表明，miRNA在膀胱癌发生发展、侵袭转移过程中发挥着十分重要的作用。但被证实的与膀胱癌相关的miRNA却很少，通过基因芯片预测到的与膀胱癌有关的miRNA不过几十种，已进行功能鉴定的miRNA仅10几个[5-20]。　　Ichimi T等[8]和Tianxin Lin[10]等芯片研究结果显示，与膀胱正常组织相比，膀胱癌组织中miR-195表达水平明显下调。但尚未进行进一步的功能鉴定。研究表明，miR-195与结肠癌、乳腺癌、肾上腺皮质癌、头颈部鳞状细胞癌、肝细胞癌呈负相关。另有芯片[5]结果显示，与膀胱正常组织相比，膀胱癌组织中miR-17-5p表达水平明显上调。有文献报道，miR-17在乳腺、肺脏、结肠、胃、肝脏、胰腺、前列腺、淋巴瘤等的肿瘤中表达上调具有普遍性，与肿瘤增殖、分化、凋亡等恶性生物学表型有关。目前，尚无miR-195和miR-17-5p在膀胱癌发生中作用机制的研究报道。本研究拟以miR-195和miR-17-5p为研究对象，通过组织学验证，生物信息学结合分子生物学方法进一步揭示其作用的靶基因，从靶基因角度初步阐明miR-195和miR-17-5p在膀胱癌发生中的作用机制，同时也为寻找膀胱癌特异性诊断的标志物和肿瘤治疗的新靶点提供新的线索。　　材料与方法:　　一、实验材料　　1、人胚肾细胞系HEK293、膀胱癌细胞系5637　　2、荧光定量PCR检测相关试剂　　3、构建表达载体相关试剂　　4、双萤光素酶报告基因检测相关试剂　　5、Western印迹杂交相关试剂　　6、流式细胞术检测相关试剂　　7、Transwell小室检测相关试剂　　8、葡萄糖摄取实验相关试剂　　9、常用实验设备如荧光分光光度计、紫外分光光度计、酶标仪、流式细胞仪、自动凝胶成像分析仪、全温振荡培养箱等。　　10、常用数据库及分析软件如TargetScan(http://www.targetscan.org)和PicTar(http://pictar.bio.nyu.edu)数据库、基因组数据库、凝胶成像及扫描分析软件、引物设计软件(Primer5)、SPSS version13.0等。　　二、实验方法　　1、qRT-PCR方法进行组织学验证miR-195、miR-17在膀胱癌和正常组织的表达。　　2、流式细胞术检测5637细胞转染miR-195、miR-17-5p siRNA表达载体后对细胞凋亡的作用。　　3、MTT实验检测5637细胞转染miR-195、miR-17-5p siRNA表达载体后对细胞增殖的作用。　　4、Transwell小室试验检测5637细胞转染miR-195、miR-17-5p siRNA表达载体后细胞侵袭力的变化。　　5、利用数据库资源，确立与miR-195、miR-17-5p作用的膀胱癌相关的候选靶基因。　　6、Western Blot检测候选靶基因在膀胱癌组织及正常组织的表达。　　7、构建萤光素酶报告基因表达载体，应用双萤光素酶报告基因检测系统检测HEK293细胞转染miR-195、miR-17-5p后萤光素酶活性变化。　　8、应用Western Blot检测5637细胞转染miR-195、miR-17-5p siRNA后候选靶基因的表达情况。　　9、通过检测候选靶基因功能活性变化鉴定miR-195、miR-17-5p在膀胱癌发生中的作用机制。　　结果:　　一、膀胱癌组织中miR-195、miR-17表达　　提取膀胱癌和癌旁组织RNA，反转录成cDNA，采用qRT-PCR方法，以U6-snRNA作为内对照，利用miR-195、miR-17特异性探针检测两种组织中miR-195中miR-17表达。结果显示与正常组织相比，膀胱癌组织中miR-195表达明显下调，而miR-17表达明显上调(P＜0.05)。　　二、miR-195、miR-17-5p对细胞凋亡的影响　　通过流式细胞术双染技术检测到miR-195促进细胞凋亡;而miR-17-5p具有抗凋亡作用。　　三、miR-195、miR-17-5p对细胞增殖的影响　　通过MTT实验检测到miR-195抑制5637细胞增殖;而miR-17-5p具有促进5637细胞增殖作用。　　四、miR-195、miR-17-5p对细胞体外侵袭能力的影响　　通过transwell小室法检测发现转染miR-195和miR-17-5p siRNA表达载体的5637细胞侵袭力较对照组明显下降(P＜0.05)。　　五、miR-195、miR-17-5p候选靶基因预测　　根据TargetScan(http://www.targetscan.org)、PicTar(http://pictar.bio.nyu.edu)和miRNAMAP(http://mirnamap.mbc.nctu.edu.tw/)数据库，结合PubMed数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)，我们得到miR-195膀胱癌候选靶基因SLC2A3(solute carrier family2(facilitated glucose transporter), member3)，miR-17-5p膀胱癌候选靶基因BRMS1L(breast cancer metastasis-suppressorl-like)。　　六、膀胱癌组织中SLC2A3、BRMS1L表达　　提取膀胱癌和膀胱正常组织总蛋白，Western Blot检测结果显示与正常组织相比，膀胱癌组织中SLC2A3表达明显增加，BRMS1L表达明显降低。　　七、miR-195对SLC2A3表达调控分子机制　　双萤光素酶报告基因检测结果显示，在HEK293细胞中，共转染pMIR-SLC2A33-UTR重组质粒和miR-195组的报告基因活性较对照组明显降低，P＜0.05。Western blot结果显示，与对照组相比，转染了miR-195的5637细胞中SLC2A3表达量明显下调。葡萄糖摄取实验结果显示与转染control miR组相比，转染miR-195组的5637细胞对葡萄糖摄取能力（单位为pmol/h/10-6 cell）显著降低，P＜0.05。　　八、miR-17-5p对BRMS1L表达调控分子机制　　双萤光素酶报告基因检测结果显示，在HEK293细胞中，共转染pMIR-BRMS1L3-UTR表达质粒和miR-17-5p组的报告基因活性相对于其它对照组明显降低，P＜0.05。Western blot结果表明，与对照组相比，转染了miR-17-5p siRNA的5637细胞中BRMS1L表达量明显上调。　　结论:　　1、miR-195通过与葡萄糖转运体蛋白SLC2A33-UTR特定基序靶向结合负性调控该基因的表达。　　2、miR-195在膀胱癌组织中低表达，miR-195能促进膀胱癌5637细胞的凋亡、抑制细胞增殖、降低细胞侵袭能力，这些作用可能通过抑制SLC2A3的表达实现的。　　3、miR-17-5p通过与BRMS1L3-UTR特定基序靶向结合负性调控该基因的表达。　　4、miR-17在膀胱癌组织中高表达，miR-17-5p能抑制膀胱癌5637细胞的凋亡、促进细胞增殖、提高细胞侵袭能力，这些作用可能通过抑制BRMS1L的表达实现的。