论文部分内容阅读
背景抑郁症是世界上最主要的致残原因,在不同国家其发病率约为15-18%,严重影响着患者的社会心理功能和生活质量。目前有大量关于抑郁症病理生理学机制方面的研究,主要有单胺类等神经递质异常、下丘脑-垂体-肾上腺素轴改变、神经可塑性失调、遗传基因、环境因素等,但并没有单一机制能较好诠释抑郁症的发病机理。慢性缺氧是重要的环境因素之一,目前研究较少。然而,我国约有1/6的高海拔地区,超过1000万人常年生活在缺氧环境中;此外,由于职业和工作需要,部分人群需长期处于氧浓度相对较低的密闭空间,因氧浓度不足导致的抑郁高发生率、高死亡率不容忽视。因此,深入探究慢性缺氧致抑郁发生的原因,完善相关病理生理学机制具有十分重要的意义。慢性缺氧会引起脑萎缩、脑白质体积减少等中枢神经系统损伤,白质区最主要的成分是髓鞘,主要由成熟少突胶质细胞形成。研究发现,压力等因素导致的抑郁症患者其大脑内存在髓鞘脱失和少突胶质细胞异常的情况,提示了脱髓鞘损伤在抑郁症发生发展中的重要地位。但是慢性缺氧引起的抑郁发生是否与脱髓鞘损伤有关却不得而知。RhoA/ROCK通路在中枢神经系统具有重要的调节作用,该通路激活与众多神经精神疾病发生密切相关。然而,RhoA/ROCK通路在抑郁症中是否具有调控作用却鲜有报道。此外,RhoA能调控细胞骨架的重组,这对髓鞘膜形成和损伤后的再髓鞘化具有重要意义。因此,我们推测慢性缺氧引起的抑郁发生可能与脱髓鞘损伤有关,RhoA/ROCK通路对该过程可能起到一定的调节作用。目的本研究旨在探究脑白质脱髓鞘损伤在慢性缺氧后抑郁发生中的作用,以及通过抑制RhoA/ROCK通路活性在保护髓鞘完整性及改善抑郁症状中的意义,以求进一步阐明慢性缺氧导致抑郁症的发病机理,为其预防和治疗提供研究证据。方法本研究分两部分进行。第一部分,探究慢性缺氧后是否会出现脑白质脱髓鞘损伤和抑郁样行为。首先确立最适缺氧时间。将8周龄C57BL/6黑色小鼠（18-25g）随机分为正常组和缺氧组。利用10%氧浓度的缺氧箱连续性缺氧30 d构建慢性缺氧模型。观察并记录不同时间点小鼠的体重变化情况和存活天数,计算生存率;分别于缺氧后1 d、3 d、7 d、14 d取材,利用qPCR检测缺氧诱导因子HIF-1α的表达、ELISA法检测神经损伤标志性蛋白S100β的表达。接着,观察缺氧后的行为和髓鞘变化情况。通过行为学实验（强迫游泳实验、糖水偏好实验、旷场试验）对比观察两组行为差异,并记录抑郁样行为的发生率;通过额叶区的脑电记录比较两组神经元放电活性,通过快蓝染色和免疫荧光染色比较两组髓鞘完整性情况。第二部分,探究抑制RhoA/ROCK通路活性对改善脱髓鞘损伤和抑郁样行为的影响。药物干预选择RhoA/ROCK通路阻滞剂Y-27632,并利用经典抗抑郁药氟西汀进行对照。首先在慢性缺氧的同时,分别对各组小鼠行腹腔注射Y-27632溶液（5 mg/kg）、氟西汀（10 mg/kg）和生理盐水,1次/d,注射14 d。接着,在14 d的缺氧和药物干预后,利用行为学实验观察各组行为变化,采用脑电记录比较各组神经元放电活动情况,通过免疫荧光染色、电镜染色和Western blot观察各组髓鞘完整性的变化情况,利用Western blot和免疫荧光染色观察髓鞘生长负性调节蛋白LINGO-1的变化,并利用Ed U染色和免疫荧光染色观察各组少突胶质细胞增殖分化情况、通过Western blot检测凋亡蛋白cleaved caspase-3的表达变化情况。结果第一部分结果如下:1.小鼠的体重随缺氧时间延长呈进行性降低,在缺氧14 d时体重趋于稳定;缺氧14 d时小鼠的存活率为100%,缺氧30 d时小鼠的存活率仅为40%。qPCR结果显示缺氧1 d时HIF-1α表达比正常组明显增高,并持续升高至14 d;ELISA检测结果显示S100β浓度在缺氧1 d时开始升高,并持续至14 d。提示缺氧14 d时模型最稳定且神经损伤较重,可将此作为最适缺氧时间。2.缺氧14 d后,小鼠抑郁样行为的发生率为66.7%。在强迫游泳实验中,缺氧组的不动时间（193.50±6.22 s）明显高于正常组（72.67±10.74 s）（P<0.0001）。在糖水偏好实验中,缺氧组的糖水摄入率（52.54±3.32%）比正常组（87.18±2.65%）低,两组相比差异显著（P<0.0001）。在旷场实验中,缺氧后的小鼠运动速度及运动总距离均明显减少,两组穿过中央区域距离与总距离的比值分别为（0.16±0.01和0.06±0.01）（P<0.0001）。EEG情况,小鼠的脑电频率和幅度均出现明显改变,其振幅范围是-105.52～101.12μV、频率是73 Hz;而正常组的脑电波振幅范围是-45.19～45.92μV,频率是16 Hz,提示了与抑郁相关脑区的神经元活动异常。4.缺氧14 d后,快蓝染色可见脑白质区髓鞘颜色深浅不均,大部分区域染色变浅,正常组和缺氧组的染色光密度值分别为（0.53±0.04和0.23±0.03）,结果相比有统计学意义（P<0.001）。通过免疫荧光染色观察髓鞘碱性蛋白MBP的表达情况,发现缺氧后大脑内海马和胼胝体等多处出现了MBP+区域的面积减少。第二部分结果如下:1.qPCR显示,缺氧后RhoA、ROCK1的表达明显高于对照组（P<0.0001）。在缺氧时运用ROCK抑制剂Y-27632进行阻断,我们发现RhoA、ROCK1蛋白的表达量明显降低。在缺氧时运用抗抑郁药氟西汀,也得到了类似的效果,蛋白的水平也有所降低,但比ROCK抑制剂组略高。2.在药物干预后,ROCK抑制剂组在强迫游泳实验中的小鼠不动时间明显低于缺氧组,糖水偏好实验中的糖水摄入率明显高于缺氧组,但均未达到正常组水平。抗抑郁药组与ROCK抑制剂组呈现出相同的趋势,但两组结果无统计学意义（P>0.05）。在旷场试验中,运动速度和运动总距离方面,两药物干预组均有明显改善,结果与缺氧组相比均有明显统计学意义;而在旷场中中心距离与总距离的比值情况,药物干预后和缺氧组无明显差异（P>0.05）。3.在药物干预后,ROCK抑制剂组和抗抑郁药组小鼠胼胝体处MBP的荧光强度明显高于缺氧组,且表达范围更广。电镜染色发现,ROCK抑制剂组和抗抑郁药组的髓鞘厚度明显改善,但仍比正常组薄。缺氧后,有髓轴突数目减少,约为正常组的20%,而在ROCK抑制剂和抗抑郁药干预后,有髓轴突数目明显恢复（分别是97.20±6.13和91.60±7.31）,与缺氧组（26.60±5.09）相比差异显著均有统计学意义,而两药物干预组相比却无明显差异（P>0.05）。G-ratio值（轴突直径/轴突+髓鞘的总直径）情况,ROCK抑制剂组的G-ratio值为0.71±0.01,明显低于缺氧组的0.86±0.01（P<0.0001）,抗抑郁药组与ROCK抑制剂组趋势一致,但两药物干预组G-ratio值无明显差异（P>0.05）,提示了在缺氧同时运用ROCK抑制剂能恢复髓鞘厚度,减少有髓轴突降解。4.髓鞘生长负性调节蛋白LINGO-1,在缺氧后表达明显升高,而在通路阻断剂Y-27632干预后出现明显降低（P<0.001）,但仍高于正常组;而两药物干预组的LINGO-1表达水平相比结果却无明显差异（P>0.05）。5.在探究脱髓鞘损伤的机制研究中,增殖方面,ROCK抑制剂组的PDFGR-α+Ed U+的细胞数（22.58±1.55%）明显高于缺氧组（10.09±1.36%）（P<0.001）;ROCK抑制剂组PCNA+的细胞数（47.62±3.63%）也明显高于缺氧组（23.05±2.61%）（P<0.001）;抗抑郁药组呈现出与ROCK抑制剂组一样的趋势。分化方面,ROCK抑制剂阻断RhoA/ROCK通路后,PDFGR-α+和O4+的细胞数明显高于缺氧组,抗抑郁药组的阳性细胞数也明显增高。在凋亡方面,缺氧组少突胶质细胞的凋亡蛋白（cleaved caspase-3）明显升高,在运用ROCK抑制剂和抗抑郁药进行干预后,其蛋白相对表达量明显降低。结论1.慢性连续性缺氧14 d可引起脑白质脱髓鞘损伤及抑郁样行为,并伴有RhoA/ROCK信号通路激活。2.在缺氧早期抑制RhoA/ROCK通路活性,能有效缓解慢性缺氧引起的抑郁样行为、改善脑白质脱髓鞘损伤并保护轴突以防降解。3.在缺氧早期抑制RhoA/ROCK通路活性,能有效解除LINGO-1对脱髓鞘损伤后再髓鞘化修复的抑制效应,促进少突胶质细胞祖细胞的增殖分化,并抑制少突胶质细胞凋亡。4.阻断RhoA/ROCK通路的活性可能调控慢性缺氧致抑郁发生发展的手段之一,其机制可能与保护髓鞘完整性有关。