论文部分内容阅读
禽腺病毒(Fowl Adenovirus,FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属。基于限制性酶切图谱分析以及血清交叉中和试验,目前可将FAdV划分为5个基因型(A-E),12个血清型(血清型1-7、8a、8b、9-11)。流行病学研究发现,FAdV在世界范围内广泛分布,且不同日龄的家禽均易感。FAdV感染一般引起亚临床症状,而急性感染主要以包涵体肝炎、肝炎-心包积液综合症以及肌胃糜烂等为主。自2013年以来,国内大部分地区鸡群中流行暴发肝炎-心包积液综合症,感染鸡群的死淘率可高达80%,对国内养鸡业造成了严重的经济损失。然目前对FAdV尚无有效的疫苗和药物进行预防和治疗,更缺乏可靠的FAdV血清学检测方法。本研究从禽腺病毒保守基因hexon着手,分别构建了 GST-hexon和pET-hexon、pCold-hexon的分段原核表达载体,进行了融合蛋白的纯化,并利用纯化的融合蛋白建立了检测FAdV抗体的间接ELISA方法。1、hexon基因的分段原核表达及纯化本研究选取禽腺病毒5个基因型毒株,通过比对其hexon蛋白氨基酸序列,选择比较保守的4段表位,设计引物克隆至pGEX-6P-1原核表达载体中,阳性质粒分别命名为GST-hexon1、GST-hexon2、GST-hexon3 和 GST-hexon4。IPTG 诱导表达后,经 SDS-PAGE 分析发现,原核表达的重组蛋白主要在沉淀中以包涵体的形式存在。Western blot鉴定发现,原核表达的重组蛋白只有GST-hexon1与抗FAdV的鸡阳性血清具有良好反应性。进而将hexon1片段克隆至pET-32a和pCold Ⅰ载体中进行蛋白可溶性表达尝试。经SDS-PAGE分析发现,原核表达产物仍然在沉淀中以包涵体的形式存在。随即对包涵体进行了纯化,蛋白浓度可达0.5mg/mL。SDS-PAGE以及Wetern blot分析表明,纯化的重组蛋白具有很好的纯度及良好的抗原反应性。这一纯化的hexon1重组蛋白的获得为进一步建立检测FAdV抗体的间接ELISA方法提供了材料。2、检测FAdV抗体的间接ELISA方法的建立利用纯化的hexon1重组蛋白作为包被抗原,建立了检测FAdV抗体的间接ELISA方法。实验数据表明,抗原的最佳包被浓度为6.2μg/mL;一抗最佳稀释度为1:400,最佳孵育时间为60min;酶标二抗最佳稀释度为1:50000,最佳孵育时间为45min;显色时间为10min。该ELISA的CUT-OFF值为OD(?)0.173。特异性检测发现,建立的ELISA与新城疫病毒、禽白血病病毒、马立克氏病毒、传染性支气管炎、传染性法氏囊病病毒阳性血清以及SPF鸡血清均没有反应,OD值均低于0.1548;仅与检测的抗FAdV的阳性血清反应。临床应用检测表明,该ELISA能用于检测FAdV免疫鸡群抗FAdV抗体水平。这些研究结果表明,本研究建立的基于Hexon蛋白的检测FAdV抗体的间接ELISA方法在FAdV感染及免疫监测中具有一定的应用价值。