骨组织是人体行使运动、支撑、保护等功能的重要组成部分,但由外伤、感染、肿瘤和先天性疾病等因素造成的不同类型的骨缺损却非常常见,且是临床治疗中的难点之一,同样颌骨的缺损也一直是口腔外科、种植修复所面临的一大难题。目前,为解决骨的来源、排异反应及力学要求等问题,骨组织再生工程成为解决骨缺损修复临床治疗问题的有效途径之一。其中,骨组织工程的关键因素是成骨细胞,成骨细胞是骨形成的基础细胞,如何获得足够数量的成熟的成骨细胞也就成为目前骨组织工程在基础研究和临床应用中的关注重点。人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)具有和人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)一样的多能性,能进行无限增殖和分化为三胚层中的各种体细胞,且hiPSCs是由人体体细胞重编程获得的,避免了hESCs存在的伦理问题,在组织发育、药物筛选和细胞疗法等领域显示出良好的应用前景。因此本课题的主要研究目的是高效率诱导hiPSCs分化为成骨样细胞,为骨组织工程提供足够数量的高质量的种子细胞。针对目前hiPSCs成骨向诱导方法起始分化条件不一致的问题,本课题分别探究了拟胚体(embryoid bodies,EBs)诱导法的最佳悬浮培养时间和单层诱导法的理想起始分化细胞密度。首先,将hiPSCs来源的EBs悬浮培养3-10天,利用RT-PCR技术分析了中胚层、神经嵴、间充质及成骨相关基因在这些样本中的表达。然后,选取悬浮时间为3天、5天、7天和10天的EBs,将其接种于明胶表面并利用成骨诱导培养基诱导分化14天,最后利用RT-PCR技术、碱性磷酸酶实验、茜素红实验及免疫荧光技术比较成骨分化效率。结果表明,3-5天是通过拟胚体法进行成骨向诱导分化的最佳悬浮时间。此外,当hiPSCs在Matrigel表面汇合到不同的细胞密度(20%、50%、80%和100%)时,采用单层诱导法进行7天、14天、21天和28天的成骨向分化,并利用上述方法分析成骨分化效率,结果表明80%起始分化密度适于单层成骨诱导分化。上述结果为接下来继续利用单层法诱导hiPSCs定向成骨分化体系的构建奠定了基础。最后,通过查阅文献,针对在胚胎向中外胚层分化过程中起重要作用的信号通路,选择CHIR99021、CYC、FGF2、SB431542、LY294002和BMP4等相关化合物,构建体外hiPSCs经中外胚层向成骨样细胞分化的诱导体系。同时,借鉴诱导hPSCs经中胚层定向诱导分化为心肌细胞的经验及逐步诱导hPSCs成骨分化的研究,将诱导hiPSCs中胚层向分化时间分为2天(D0-D2阶段)和5天(D3-D5阶段)。首先,当hPSCs在Matrigel表面汇合到80%的细胞密度时,利用上述化合物分别进行2天的中胚层向诱导,并利用RT-PCR技术检测中胚层及成骨相关基因的表达。随后,利用成骨诱导培养基继续诱导其分化14天并检测成骨分化效率。结果显示:CHIR99021和SB431542是D0-D2阶段的最有效的化合物。在确定前2天条件的基础上,继续利用上述化合物分别进行3天的中外胚层向诱导,利用RT-PCR技术检测中胚层、神经嵴、间充质及成骨相关基因的表达,并分析继续成骨分化14天后的成骨效率,确定了D3-D5阶段最有效的化合物为BMP4。后期,将继续探索小分子诱导中外胚层样细胞向间充质样细胞分化,继而向成骨样细胞分化,最终实现高效率的hiPSCs成骨分化,对继续构建成分明确的hiPSCs定向成骨分化诱导体系具有重要意义。