论文部分内容阅读
共轭亚油酸（ConjugatedLinoleicAcid，CLA）在动物和人体中具有抗癌、抗动脉粥样硬化、抗糖尿病、抗氧化、抗菌、降低胆固醇、促进生长等保健功能。然而，共轭亚油酸在天然食品中含量较低，构建和利用基因工程菌安全高效地产生共轭亚油酸具有广阔的应用前景。本文将来源于嗜酸乳杆菌（LactobacillusacidophilusAS1.1854）和植物乳杆菌（LactobacillusplantarumAS1.555）的亚油酸异构酶基因，取代毕赤酵母GS115（PichiapastorisGS115）基因组上原有的醇氧化酶（alcoholoxidase，AOX）基因，构建以甲醇为诱导物的重组毕赤酵母工程菌。利用BioEidt软件预测分析目的基因序列中的限制性酶切位点，结合pPICZαA穿梭质粒载体上的多克隆位点，分别设计合成了嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌亚油酸异构酶基因的PCR引物。利用上述引物，以本实验室保存的含嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶基因的pMD19T-PDI质粒为模板PCR扩增目的基因，大小约为1760bp。将目的基因与pMD19T载体连接转入大肠杆菌DH5α，经抗性筛选、双酶切鉴定、PCR鉴定后获得含目的基因的质粒命名为pMD19T-LAI。分别使用XhoI和XbaI酶切测序正确的重组质粒pMD19T-LAI和穿梭质粒pPICZαA，经电泳分离、胶回收后，连接构建酵母基因表达载体并转入大肠杆菌DH5α。经抗性筛选、双酶切鉴定和PCR鉴定后，获得了酵母基因表达载体命名为pPICZαA-LAI。将酵母表达载体线性化后，分别采用化学法和电转化法转化至毕赤酵母。抗性筛选、PCR鉴定后获得了转嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶基因的酵母工程菌。将鉴定为阳性的重组酵母GS115/LAI进行摇瓶发酵，分离菌体和发酵液，上清液用SDS-PAGE蛋白电泳检测。分别对菌体和上清液进行酶活力测定，证明转基因酵母工程菌的发酵上清液中，亚油酸异构酶活性为0.107U。目前尚未见到相关报道。利用上述引物，以植物乳杆菌基因组为模板，利用PCR技术扩增亚油酸异构酶基因，大小约为1710bp。将目的基因与pMD19T载体连接转入大肠杆菌DH5α，经抗性筛选、双酶切鉴定、PCR鉴定以及测序后，获得含目的基因的质粒，命名为pMD19T-LPI。分别使用EcoRI和XbaI酶切测序正确的重组质粒pMD19T-LPI和穿梭质粒pPICZαA，经电泳分离、胶回收后，连接构建酵母基因表达载体并转入大肠杆菌DH5α。经抗性筛选、双酶切鉴定和PCR鉴定以及测序后，获得酵母基因表达载体，命名为pPICZαA-LPI。将酵母表达载体线性化后，分别采用化学法和电转化法转化至毕赤酵母。经抗性筛选、PCR鉴定，获得转植物乳杆菌亚油酸异构酶基因的酵母工程菌。将鉴定为阳性的重组酵母GS115/LPI进行摇瓶发酵，分离菌体和发酵液，上清液用SDS-PAGE蛋白电泳检测。对上清液进行酶活力测定，证明在转基因酵母工程菌的发酵上清中具有亚油酸异构酶活性，酶活力0.130U。