基于iTRAQ技术对铁还原菌AMDY2--9--2在有铁和无铁条件下蛋白质组研究

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随着经济发展,人类对矿产的需求越来越大,对矿山的开发活动也越来越频繁,这就产生了大量的废石、废渣和酸性矿山废水,严重危害了生态系统,给人类健康带来重大威胁。在酸性矿山环境形成的过程中,铁的氧化与还原在其中扮演了一个重要角色。本论文以一株分离自安徽铜陵狮子山酸性矿山环境中的铁还原菌AMDY2-9-2为研究对象,对其还原Fe(Ⅲ)的特性进行研究,并利用iTRAQ技术对其在有铁和无铁环境下蛋白质组进行研究,为从蛋白水平揭示其还原铁提供理论依据,同时也有望为酸性矿山环境的治理和生物修复提供理论依据。  对AMDY2-9-2再次进行16S rDNA测序,并与原始16S rDNA序列进行比对,结果表明表明AMDY2-9-2无变异发生。对AMDY2-9-2的培养基进行改良,首先将三价铁离子的来源从硫酸亚铁的自然氧化改良成硫酸铁,结果表明菌AMDY2-9-2能正常生长并还原铁离子;其次将菌接入无铁的培养基中,结果表明菌AMDY2-9-2同样能生长,这为其差异蛋白质组的分析提供了基础。对AMDY2-9-2在有铁和无铁培养基生长过程中的生长周期,pH、Eh、SO42-浓度变化等参数进行研究,表明菌AMDY2-9-2在有铁组从第2天进入对数生长期,第6天进入稳定期,第16天之后进入衰亡期;无铁组同样从第2天进入对数生长期,但持续时间更长,到第8天进入稳定期,第14天以后,进入衰亡期。有铁组的pH随着时间会先降低后稳定,无铁组的的pH基本保持不变;有铁组的Eh随着时间基本保持不变,无铁组的Eh则处于先不断降低,后稳定不变的趋势;有铁组和无铁组的硫酸根变化都是先升高后保持稳定,变化趋势一致。AMDY2-9-2还原溶液三价铁离子实验和与针铁矿中结构铁的实验结果表明,培养基中二价铁离子的浓度都有增加,说明菌AMDY2-9-2确实可以还原三价铁离子,但是AMDY2-9-2还原针铁矿中的三价铁离子的还原速率非常慢,是一个长时间的过程。AMDY2-9-2的扫描透射软X射线显微镜观察结果表明,菌体表面附着大量铁,且二价铁的量多于三价铁的量。  利用iTRAQ技术联合LC-MS/MS技术对菌AMDY2-9-2蛋白质组的研究中分为实验组和对照组,实验组即AMDY2-9-2的培养基中有三价铁存在,对照组培养基中无三价铁存在,实验组和对照组均设三个平行。结果共检出1368个蛋白,差异蛋白170个,其中上调蛋白106个,下调64个。对差异蛋白进行GO分析结果发现与金属结合蛋白、铁离子结合蛋白、铁-硫结合蛋白上调非常明显,与氧化还原,电子传递有关的蛋白也上调显著,统计得出有这些功能的差异蛋白有33个,其中有的蛋白有多个分子功能;这33个差异蛋白中有19个蛋白有metal cluster binding的功能,有4个蛋白有iron ion binding的功能,有19个蛋白有iron-sulfur cluster binding的功能,有10个蛋白有4 iron,4 sulfur cluster binding的功能,有5个蛋白有oxidoreductase activity, acting on CH or CH2 groups的功能,有2个蛋白有formate dehydrogenase (NAD+) activity的功能,可初步将这些蛋白作为菌AMDY2-9-2还原铁功能的关键蛋白进行深入的研究。通过对差异蛋白进行GO和KEGG Pathway综合分析,发现亮氨酸的代谢是一个重要过程,可能与AMDY2-9-2还原铁的的功能有关,也可将这些蛋白作为潜在功能蛋白开展后续研究。
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