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柚皮苷是一种二氢黄酮糖苷类化合物,主要分布于柚子、橙子等植物的果皮、果肉以及一些中草药中,其在α-L-鼠李糖苷酶的催化作用下可定向生成产物普鲁宁,从而提高柚皮苷的生物利用价值。在实验室前期研究工作中已制备得到重组的α-L-鼠李糖苷酶,在此基础上,进行柚皮苷的酶法转化制备普鲁宁以及固定化酶的研究。首先采用热水煮提法提取柚皮中的活性物质,再筛选出吸附解吸效果最优的大孔吸附树脂D101树脂,在提取液中添加量为3.0%,设置摇床温度为25℃,振荡速率180 r/min,105 min后吸附完全。吸附饱和的树脂湿法上柱进行动态洗脱,洗脱液经萃取纯化后可得到纯度为95.8%的柚皮苷和90.9%的柠檬苦素。然后,利用重组的α-L-鼠李糖苷酶水解柚皮苷,同时采用DNS法对酶解过程进行动态分析,结果表明,酶解反应的最适反应温度为60℃,pH值为4.0,加酶量12 U/mL,底物浓度0.20 g/100 mL,振荡速率120 r/min。在此最优工艺条件下,300 min后柚皮苷转化率达到94%。高浓度的Mn2+、Fe2+对酶解过程起到激活剂的作用。Lineweaver-Burk双倒数拟合曲线的Km=590μg/mL,Vmax=0.011 mg/（mL·min）。经过TLC法和HPLC法验证得出反应完全后可得到反应产物普鲁宁和鼠李糖。选择合适的树脂载体对柚皮苷进行固定化,得出D101-1大孔吸附树脂最适合做载体。α-L-鼠李糖苷酶催化固定化柚皮苷水解的最适条件为酶用量30 U/mL,最适酶反应温度为60℃,pH值为4.0,底物浓度为0.24 g/100 mL,振荡速率为80 r/min。在此条件下,酶解反应420 min后,转化率达到77.8%。高浓度的Mn2+、Fe2+对酶解反应有极强的促进作用。Lineweaver-Burk双倒数拟合曲线的Km=5120μg/mL,Vmax=0.013 mg/（mL·min）。经过TLC法和HPLC验证得出反应完全后可得到纯的反应产物普鲁宁和鼠李糖。利用聚乙烯醇-海藻酸钠为包埋载体,以戊二醛为交联剂制备固定化α-L-鼠李糖苷酶,结果表明,11%PVA与0.5%海藻酸钠作为载体,加入浓度为2%的戊二醛交联2 h后,加入粗酶液77 U/mL,静置吸附3 h,挤入4%硼酸与1%CaCl2混合溶液中固化,然后置于pH 5.0缓冲液中保存后酶活回收率可达到34.2%。游离和固定化的α-L-鼠李糖苷酶最适温度均为55-60℃,温度稳定性基本不变,最适pH均为5.0,但pH稳定性得到提高。经过动力学分析得出固定化后酶与底物分子的亲和力有所下降。该固定化酶在连续使用7次后酶活仍然保留72%,具有良好的重复利用性。